IX.1. Тест на аллелизм как этап изучения гена

Ген идентифицируется на основе мутаций, нарушающих его функцию и приводящих к образованию измененного генного продукта, и, в конечном итоге, к изменению контролируемого им признака. Поэтому для проведения анализа гена прежде всего необходимо иметь возможно больше мутаций, затрагивающих изучаемый признак. Однако эти мутации могут быть локализованы как в одном гене, так и в нескольких генах. Принадлежность рецессивных мутаций одному или разным генам выявляется с помощью специального теста на функциональный аллелизм (или на комплементарность). Тест на аллелизм сводится к получению транс-гетерозигот по рецессивным мутациям, изменяющим один признак, для чего скрещивают мутантные формы между собой.

Если мутации затрагивают один ген, то в зиготу попадают только мутантные аллели этого гена - один от одного, другой от другого родителя. В ней нет нормального аллеля, поэтому ее фенотип мутантный

Если мутации затрагивают разные гены, то от каждого родителя в зиготу попадает мутантный (рецессивный) аллель по одному и нормальный (доминантный) аллель по другому гену, что обеспечивает проявление фенотипа дикого типа ( если гены локализованы в разных хромосомах, или если гены сцеплены). Следовательно, мутации, проявляющие в транс-положении мутантный фенотип, не комплементарны, т. е. аллельны; мутации, обеспечивающие в транс-гетерозиготе фенотип дикого типа, комплементарны, т. е. неаллельны.

На высших эукариотах при проверке на аллелизм скрещивают мутантные формы и анализируют фенотип потомков F₁.

Для проверки на аллелизм пяти хлорофильных мутаций гороха было поставлено семь скрещиваний. Определить число генов, в которых возникли эти мутации, и выявить мутации, принадлежащие одному гену.

В скрещиваниях 1, 2, 3 и 7 нет комплементации - гибриды имеют мутантный фенотип. Следовательно, эти мутации возникли в одном гене, они аллельны. В скрещиваниях 4, 5 и 6 наблюдается эффект комплементарности - возникает дикий тип. Следовательно, мутация, вызывающая желтую окраску, локализована в другом гене.

Мутации, вызывающие светло-зеленую, полосатую и белую окраски, локализованы в одном, желтую в другом гене.

На низших эукариотах для проведения теста на аллелизм получают диплоидные гетерозиготные клетки от скрещивания двух мутантов (или гетерокарионы), которые испытывают на соответствующей селективной среде, где каждый из гаплоидных мутантов не растет, а рост гетерозиготной клетки обнаруживается только при скрещивании мутантов по разным генам.

На основе теста на комплементарность составлена матрица комплементации, в которой записано наличие (+) или отсутствие (0) комплементации при попарных скрещиваниях девяти фенотипически одинаковых мутантов у нейроспоры (табл. IX. 1). Определить, аллельны ли эти мутации.

Таблица IX.1. Матрица комплементации

1. Мутации 1 и 4, 1 и 8, 5 и 8, 8 и 9 не комплементируют, следовательно, принадлежат одному гену (условно 1).
2. Мутации 2 и 6, 6 и 3, 3 и 7 не комплементируют, следовательно, относятся к одному гену, однако не к гену 1, так как мутация 2 комплементирует с 1,4,5 и 8; мутация 3 - с 4,8 и 9; мутация 6 с 1, 4 и 5; мутация 7 - с 1,8 и 9.

Девять мутаций нейроспоры относятся к двум разным генам. В одном из них 1, 4, 5, 8 и 9, в другом - 2, 3, 6 и 7 мутации.

При постановке теста на аллелизм следует помнить, что в ряде случаев мутации, принадлежащие одному гену, могут проявлять эффект комплементации - межаллельная комплементация. Она возможна в том случае, когда ген кодирует субъединицу гомомультимерного белка. В гетерозиготе, содержащей два разных мутантных аллеля, их продукты взаимодействуют при формировании четвертичной структуры белка. При этом возможна взаимная компенсация мутаций и восстановление до 20-30% (или (меньше) ферментативной активности, свойственной гомозиготе дикого типа. Как правило, этого достаточно для проявления нормального фенотипа ("псевдодикий" тип). Комплементируют только некоторые комбинации предполагаемых аллельных мутаций, и если две из них комплементарны между собой, но не комплементарны с третьей мутацией, то это означает, что они принадлежат одному гену. Их принадлежность одному гену обнаруживается и при сопоставлении активности фермента у транс- и цис-гетерозигот: у транс-гетерозигот активность фермента ниже, чем у цис-гетерозигот. Активность фермента в гетерозиготах обоих типов в случае неаллельности мутаций одинакова.

После установления принадлежности нескольких мутаций одному гену можно проводить внутригенное картирование.