IX.2.1. Метод перекрывающихся делеций

Его применяют для картирования генов у прокариот. У низших эукариот делеционные мутанты достаточно редки и их трудно получить, у высших эукариот они, кроме того, часто летальны в гомозиготном состоянии, поэтому их мало используют для внутригенного картирования.

Однако принцип делеционного картирования применяется при цитологическом картировании хромосом у дрозофилы и рестриктном картировании (см. гл. VIII). Целесообразно рассмотреть его более подробно.

Делеционные мутанты узнаются по отсутствию реверсий к дикому типу и отсутствию рекомбинаций с другими мутациями, которые рекомбинируют между собой. Для картирования с помощью делеций сначала определяют протяженность и границы этих делеций путем скрещивания делеционных (многосайтовых) мутантов с серией ревертирующих (односайтовых или точковых) уже картированных мутаций. Например, скрещивают шесть делеционных мутантов (А, В, С, D, Е и К) с пятнадцатью точковыми мутантами, мутации которых локализованы в следующем порядке:

Очевидно, что при скрещивании с делеционным мутантом не будет возникать рекомбинации, если точковая мутация локализована в области делеций (например, А×2, А×4, В×6 и т. п.). Исходя из этого можно определить границы каждой делеций. Результаты такого анализа представлены в табл. IX.2.

Таблица IX.2 Рекомбинационная матрица

Примечание: + наличие рекомбинации, 0 отсутствие рекомбинации.

На основе этих данных можно сказать, что делеционный мутант К имеет делецию в области, где локализованы мутации 2-14 (1 делеция), так как только с мутантом № 1 образует реком-бинантов. Делеционный мутант А имеет делецию в области 2,4,7,8, так как не рекомбинирует с ними (II). Аналогично делеционный мутант В имеет делецию в области 6, 9(111), С - в области 3,5,6,8,9,15 (IV), D - в области 3,4,7,8 (V), Е - в области 10,11,12,13 (VI) (рис. IX.1). Можно построить топографическую карту шести делеций (I-VI).

Рис. IX. 1. Топографическая карта делеций I-VI

Установив границы делеций в каждом из делеционных мутантов, их последовательно скрещивают с ревертирующими (точковыми) мутантами, которые хотят прокартировать.

Рис. IX.2. Топографическая карта делеций I-VII

Для локализации 10 толковых мутаций в гене rII фага Т4 мутантов скрестили с 7 делеционными мутантами. Топографическая карта делеций представлена на рис. IX.2, результаты рекомбинационного анализа в табл. IX.3.

Таблица IX.3 Рекомбинационная матрица

Примечание: + наличие рекомбинаций, 0 отсутствие рекомбинаций.

1. Мутант 6 не рекомбинирует ни с одним делеционным мутантом, мутация 6 может быть локализована в области перекрывания всех делеций, т. е. в делеций VII, на участке К.
2. Мутанты 1 и 2 не рекомбинируют с I и рекомбинируют с остальными делеционными мутантами, они локализуются в области делеций I на участке а.
3. 7,8,9 и 10 мутации не рекомбинируют с I и II и рекомбинируют с остальными делеционными мутантами, они локализуются в области перекрывания I и II делеций на участке b.
4. Мутант 3 не рекомбинирует с I, II и III мутантами и рекомбинирует с остальными, мутация 3 расположена в области перекрывания делеций I, II и III на участке с.
5. Мутант 4 не рекомбинирует с I-V и рекомбинирует с остальными, мутация 4 локализована в области перекрывания I-V делеций на участке е.
6. Мутант 5 не рекомбинирует с I-VI и рекомбинирует с VII делеционными мутантами, мутация 5 локализована в области перекрывания I-VI делеций на участке g.

10 точковых мутаций локализованы в гене rII фага Т4 на следующих участках:

Для дальнейшей локализации четырех мутаций 7,8,9,10 - мутантов скрестили с делеционными мутантами, локализованными на участке II (b) карты. Результаты скрещиваний и топографическая карта делеций представлены на рис. IX.3 и в табл. IX.4.

Рис. IX.3. Топографическая карта делеций II, VIII-XII

Анализ рекомбинаций показывает, что мутация 8 локализована в области перекрывания VIII, IX и XII делеций на участке п, мутации 7,9, 10 - в области перекрывания VIII и XII делеций на участке m.

Таблица IX.4 Рекомбинационная матрица

Затем устанавливают взаимное расположение мутаций 7,9 и 10 на участке m по частоте рекомбинаций, возникающих при скрещивании этих мутантов между собой.