3.1. Иммунные сыворотки (общие принципы работы)

Существует несколько источников иммунных сывороток к антигенам системы HLA:

- беременные женщины, проходящие естественную иммунизацию антигенами плода в период беременности;

- лица, подвергавшиеся по разным поводам многочисленным гемотрансфузиям чужой крови, что приводит к изосенсибилизации;

- реципиенты трансплантированного органа или ткани, вырабатывающие антитела к донорской ткани;

- волонтеры, подвергающиеся направленной искусственной иммунизации тканями определенной антигенной специфичности.

Вначале мы остановимся на некоторых вопросах серологии и серографии, касающихся общих принципов работы с иммунными Реагентами.

Получение и хранение иммунных сывороток. Полученную из вены кровь (одного из перечисленных выше источников) отстаивают при комнатной температуре при 37°С не менее 1 ч или несколько часов.

Следующий этап - отстаивание крови на холоду (4°С) в течение 2 - 3 дней для выпадения всех фибриновых элементов в сгусток с последующим отделением сыворотки от сгустка путем центрифугирования.

Сыворотка, полученная таким путем, разливается на малые порции, инактивируется при 56°С в течение 30 мин в водяной бане и закладывается на хранение, которое осуществляется в холодильных шкафах при -70°С. Если сыворотки предполагается израсходовать в течение ближайших месяцев, то их можно хранить при -20°С. Если реактивы перед употреблением оказались недостаточно прозрачными, их "осветляют" центрифугированием в течение 1 ч при 15 000 об/мин.

Серографический анализ при составлении коллекций иммунных сывороток. В настоящее время, когда сыворотки и антигены сравнимы друг с другом, получены моноспецифические стандарты, составление коллекции которых включает три момента:

- на основе моноспецифических стандартов составляется контингент тест-доноров, т. е. людей с известным набором антигенов гистосовместимости (70 - 50 человек);

- клетки тест-доноров служат субстратом для "просеивания" (screening) иммунных сывороток, в результате чего отбираются активные образцы с первично определенной специфичностью;

- активные образцы подвергаются вторичной идентификации на расширенной панели тест-клеток (100 - 70 образцов) с последующим вычислением коэффициентов корреляции или между реактивностью сыворотки и содержанием соответствующего антигена в тест-клетках, или между реактивностью "неизвестной" сыворотки и реактивностью известного моноспецифического "стандарта".

В обоих случаях используют коэффициент корреляции, вычисляемый на основе числовых значений конкордантных и дикон-кордантных случаев.

Формула для вычисления коэффициента корреляции R = √χ²/N, где N общее число реакций сыворотки с тест-клетками (положительных и отрицательных). Для получения значения χ² используют "сетку 2 × 2", отражающую число конкордантных и дисконкордантных случаев реагирования:

Формула для вычисления χ² следующая:

которая после преобразования превращается в

где а - число позитивных реакций сыворотки х с клетками, несущими А-антиген; b - число негативных реакций сыворотки х с теми же клетками; с - число позитивных реакций сыворотки х с клетками, не несущими А-антиген; d - число негативных реакций сыворотки х с теми же клетками.

Коэффициент корреляции является важнейшей характеристикой сывороточного образца. На Уоркшопе 1970 г. в Лос-Анжелесе были выработаны критерии, согласно которым:

а) если R между сывороткой и известным антигеном больше 0,7, то сыворотка считается содержащей антитела преимущественно к этому антигену; если 0,9 и более - сыворотка является "моноспецифическим стандартом";

б) если R между двумя неизвестными сыворотками 0,8 и более, они считаются открывающими одну и ту же антигенную специфичность.

Другая важнейшая характеристика сыворотки - сила реакции. Из всех случаев позитивных реакций сыворотка должна давать 60 - 70% "сильных" реакций, оцениваемых в двухэтапном лимфоцитотоксическом тесте 3 - 4 полюсами, для того чтобы быть включенной в международную коллекцию (Serum-set).

Ниже представлена схема обработки сывороток, используемая в одной из ведущих лабораторий тканевого типирования - лаборатории Калифорнийского университета, руководимой Р. Тегаsaki.

Схема 1

Обработка сывороток по м. pARK (1980)

После первичного скрининга выделяются сыворотки, обнаруживающие активность только на В-лимфоцитах, а также образцы, содержащие как Т-клеточные, так и B-клеточные антитела. Сыворотки, обнаруживающие слабую НLА-А,В,С-активность, вместе с сыворотками, обнаружившими анти-В-активность, поступают на тромбоцитарную адсорбцию (см. далее) и после нее на окончательный HLA-DR-скрининг.

3.1.1. Анти-НLА-А,В,С-сыворотки

Кровь беременных женщин является основным источником получения анти-НLА-А,В,С-реагентов.

Впервые антитела к лейкоцитарным антигенам в крови беременных женщин были обнаружены в 1958 г. двумя коллективами исследователей: J. van Rood и сотр. в Нидерландах и R. Payne и М. Rolfs в США.

Более чем 20-летний опыт работы по отбору реагентов этого вида показывает, что сыворотки беременных содержат HLA-A,B,C-антитела в 10 - 25% случаев, при этом стойкие антитела достаточно высокого титра образуются в третьем триместре беременности.

Значительное практическое исследование по характеристике данного источника активных иммунных реагентов анти-НLА-А,В,С выполнили G. Rodey et al. (1976); они провели анализ 3662 сывороток от женщин, перенесших не менее четырех беременностей. Из этого количества было выделено 683 (18,7%) образца, которые были позитивны по крайней мере с одним из 24 вариантов тестируемых клеток. Однако в качестве реагентов могли быть использованы только 40% из позитивных сывороток, так как остальные давали много ложнонегативных реакций или не могли быть идентифицированы. Таким образом, "выход" образцов, пригодных для закладки в коллекцию, составил 7,5% от общего количества скринированных сывороток.

Аналогичное исследование проведено нами совместно с А. Г. Долбиным [Зарецкая Ю. М. и др., 1979; Долбин А. Г., 1980). Из 1310 скринированных сывороток беременных женщин, перенесших 3 - 10 беременностей, 101 образец обнаружил сродство к определенному антигену (7,7%), т. е. составил коллекционный фонд.

В практическом отношении интересен вопрос о специфичности антител, наиболее часто обнаруживаемых в крови беременных женщин. В табл. 27 представлены сравнительные данные двух авторских коллективов, исследовавших этот аспект HLA-A,B,C-серологии.

Выделено 5 наиболее часто идентифицируемых специфичностей сублокуса А и 6 - сублокуса В. Результаты во многом совпадают; исключение составляет специфичность А1, образование антител к которой у нашего населения имеет место гораздо реже, чем у американского, и специфичность В13, где отношения обратные.

Таблица 27

^*(Число сывороток определенной специфичности на 1000 скринированных образцов.)

3.1 .2. Анти-В-сыворотки

Данная группа сывороток открыта недавно (1973 - 1974). С детерминантами В-лимфоцитов реагирует конгломерат антител, специфичных к антигенам, входящим в HLA-комплекс (анти-DR-сыворотки), и к антигенам, картированным, по-видимому, вне HLA- комплекса ("B-холодовые" сыворотки).

В настоящий момент основные усилия клинической иммуногенетики направлены на выделение анти-DR-сывороток, базой получения которых являются анти-В-сыворотки.

В принципе для получения анти-В-сывороток могут служить все 4 источника, упомянутые в начале этой главы. Однако пациенты, иммунизированные гемотрансфузиями, так же как и реципиенты аллогенного трансплантата, могут быть использованы только для получения небольших количеств сыворотки. Поэтому основным "источником" В-активных сывороток остается кровь беременных женщин, характеристику которой в данном аспекте мы приводим ниже.

Кровь беременных женщин как источник В-сыворотки. В исследовании находилась 181 сыворотка женщин, перенесших не менее одной беременности; сыворотки были подвергнуты адсорбции (см. далее) пулом тромбоцитов от 100 человек. Процедура состояла в инкубации сыворотки с тромбоцитами в течение 1 ч при комнатной температуре; полноту адсорбции контролировали постановкой обычного лимфоцитотоксического теста на лимфоцитах периферической крови. Анти-В-активность сывороток тестировали на обогащенных В-лимфоцитами суспензиях, содержание В-клеток в которых было не менее 65%. Сыворотка рассматривалась как содержащая В-клеточные антитела, если она реагировала не менее чем с двумя клеточными образцами на панели, состоящей из 20 - 25 клеток.

В данном исследовании мы пытались выяснить следующие моменты:

1. Степень В-иммунизации за счет беременности.

2. Зависимость В-иммунизации от группы крови АВ0 и от фенотипа.

3. Влияние числа беременностей на степень иммунизации, т. е. увеличивается ли фракция активных сывороток с нарастанием числа беременностей.

4. Влияние числа беременностей на "силу" сыворотки.

5. Влияние числа беременностей на ширину спектра В-клеточных антител.

Результаты представлены в нескольких таблицах, приводимых ниже (табл. 28, а, б).

Таблица 28

а. Группы крови и резус-фактор

б. Комбинированный анализ

^*(Материал статистически недостаточен для выводов.)

Групповой фактор не вносит большого разнообразия в степень иммунизации - примерно ¹/₅ сывороток беременных женщин первых трех фенотипов АВ0 содержит В-клеточные антитела, некоторое увеличение (до ¹/₃ отмечается в 0 группе (табл. 28,а). Как уже отмечалось [Зарецкая Ю. М., 1974], для анти-НLА-А,В,С-сывороток Rh-отрицательность является фактором, предрасполагающим к образованию антител, направленных к структурным единицам HLA-комплекса; та же закономерность справедлива для В-иммунизации, которая в этой группе достигает 30% (табл. 28, б). Комбинированные данные (табл. 28, б) показывают, что наиболее продуктивным источником сывороток, содержащих В-антитела, являются женщины группы крови 0, Rh; фракция активных сывороток здесь составляет 36%. Незначительное число сывороток группы АВ не позволило сделать достаточно обоснованных выводов по этой группе. Фракция активных сывороток, содержащих В-антитела по всем изученным группам, составила 22% (40/181).

Рис. 18. Зависимость В-иммунизации от числа беременностей. Верхние цифры - процент сывороток, содержащих антитела против В-лимфоцитов, заштрихованные столбики - сила реакции (в плюсах), которую вычисляли путем сложения всех реакций и деления суммы на число сывороток

Для ответа на 3-й из поставленных выше вопросов все сыворотки были разделены на 4 группы в зависимости от числа беременностей и в каждой из групп была определена фракция активных сывороток. Рис. 18 отражает полученные данные. Фракция активных сывороток несколько увеличивается с числом перенесенных беременностей, однако это увеличение статистически незначимо. Следует отметить резкое снижение доли В-активных сывороток при большом числе беременностей. Между тем группа с большим числом беременностей является наиболее продуктивной для отбора сывороточных образцов, содержащих антитела к HLA-А,В,С-сублокусам [Зарецкая Ю. М., 1974].

По-видимому, при многократно повторяющейся беременности идет своеобразный отбор HLA,В,С-активных антител, которые поглощают или элиминируют В-активные антитела. Так же и для HLA-А,В,С-сывороток не удалось установить зависимости междунарастанием силы реакции и числом беременностей (рис. 18).

Далее было проведено обследование зависимости широты спектра В-антител в активных сыворотках от числа беременностей. Было предположено, что между широтой спектра антител, содержащихся в конкретной сыворотке, и числом положительно реагирующих клеточных образцов в тест-панели существует прямая зависимость. Поэтому широту спектра антител в каждой из выше упомянутых групп оценивали по среднему проценту положительно реагировавших образцов клеток, приходящихся на одну сыворотку. Результаты, представленные на рис. 19, свидетельствуют о том, что наибольший спектр антител приходится на группу сывороток от женщин, перенесших 4 - 6 беременностей; с дальнейшим ростом числа беременностей происходит сужение спектра антител. Нам представляется, что наиболее ценной для отбора коллекционных образцов анти-В-сывороток являются сыворотки от женщин, перенесших 10 и более беременностей, хотя фракция В-активных сывороток в этой группе ниже, чем в других (см. рис. 18).

Рис. 19. Зависимость широты спектра В-антител от числа беременностей. Пояснения в тексте

В хорошем соответствии с нашими данными находятся факты, сообщенные Н. А. Нармухамедовой с соавт. (1980), которые не обнаружили зависимости между частотой образования DR-антител и числом беременностей. Авторами показано, что при очень большом числе беременностей (>10) фракция сывороток, содержащих DR-антитела, сокращена по сравнению с остальными группами.

Тромбоцитарная адсорбция для получения анти-В-сывороток.

Сыворотки, содержащие В-клеточные антитела, часто насыщены HLA-А,В,С-антителами, поэтому они, как правило, подвергаются предварительной стандартной обработке, заключающейся в инкубапии на смеси тромбоцитов от многих индивидуумов. Такая обработка приводит к адсорбции HLA-А,В,С-антител на тромбоцитах и "обогащению" сыворотки В-антителами. Ряд исследователей [Richiardi P. et al., 1977; Majsky А., 1979] считают, что отбор сывороток в aHTH-DR-коллекцию не может быть произведен без предварительной адсорбции "подозреваемых" образцов на пуле тромбоцитов. Адсорбция производится на смеси тромбоцитов от 20 - 100 человек или в случае, когда известна специфичность HLA-антител, "загрязняющих" сыворотку, на тромбоцитах соответствующей HLA-специфичности.

Процедура адсорбции относительно проста, однако есть ряд моментов, ее лимитирующих. Поэтому нет устоявшегося и методического единодушия в вопросе о необходимости адсорбции и ее особенностях.

Основные разногласия касаются трех моментов:

1. "Емкость" пула тромбоцитов, необходимого для полной адсорбции НLА-А,В,С-антител; используемые "емкости" разнообразны по диапазону: от 20 [Bodmer J. et al., 1977] до 200 [Borelli I. et al., 1979] клеточных образцов в пуле.

2. Объем используемой тромбоцитарной массы по отношению к объему сыворотки: наиболее распространенное соотношение - 1 объем "упакованных" тромбоцитов и 1 объем сыворотки [Park М. et al., 1977], однако используют ¹/₂ объема тромбоцитов на 1 объем сыворотки [Bodmer J. et al., 1977].

3. Необходимость адсорбции для "пустых" по НLА-А,В,С-активности сывороток.

Учитывая эти спорные вопросы, мы провели специальное исследование совместно с В. Ю. Абрамовым и В. В. Яздовским.

Было отобрано 20 сывороток, полностью негативных в обычном тесте к комплементзависимой цитотоксичности на ЛПК (так называемые пустые сыворотки).

Будучи неадсорбированными, ряд этих сывороток в удлиненном дитотоксическом тесте обнаружил позитивную активность как на В-лимфоцитах, так и на ЛПК (сыворотки 3 и 24, табл. 29). После адсорбции пулом тромбоцитов от 25 человек и последующем скрининге на ЛПК сыворотки были полностью негативны, а сыворотки 3 и 24 оказались негативными и на В-лимфоцитах.

Этот эксперимент показал, что в удлиненном цитотоксическом тесте, основном методе скрининга В-сывороток, может проявляться активность слабых HLA-антител, если не произведена предварительная тромбоцитарная адсорбция. Данная активность раскрывается благодаря созданию более благоприятных условий для взаимодействия антител с антигенными детерминантами и обусловлена большей концентрацией HLA-А,В,С-рецепторов на поверхности В-лимфоцитов, нежели Т-лимфоцитов. Из наших экспериментов (см. табл. 29) следует, что группа "пустых" сывороток, полностью негативных в обычном тесте комплементзависимой цитотоксичности на ЛПК, является неперспективным источником для отбора анти-В-реагентов, так как обнаруживает, как правило, слабую реактивность на В-лимфоцитах.

Таблица 29

Следующий этап работы состоял в определении оптимального тромбоцитарного пула. В анализ были взяты 2 группы сывороток: "слабые", реагировавшие от 2 до 6 (см. 2.1.1) на лимфоцитах периферической крови и обнаружившие слабую реактивность не более чем на ¹/₃ клеток в панели, состоящей из 50 образцов, и сильные полиспецифические сыворотки, реагировавшие на ЛПК от 6 до 8 (и не являющиеся анти-HLA-А2).

Из "слабой" группы 10 сывороток были подвергнуты ступенчатой адсорбции пулом тромбоцитов от 25, 50, 75 и 100 индивидуумов; количественные соотношения между тромбоцитами и сывороткой выдерживались всегда одни и те же. Результаты показали (табл. 30), что для этой группы сывороток была необходима адсорбция пулом тромбоцитов не менее чем от 100 человек. При меньшем пуле сохранялась определенная ЛПК-реактивность, значения которой не превышали 4. "Выход" активных анти-В-сывороток, Дающих после адсорбции "читаемые" реакции с суспензией В-лимфоцитов, незначительно увеличивался при увеличении пула тромбоцитов; в то же время весьма ощутимо снижалось число "неопределенных" (2) реакций, В-клетками, затрудняющих чтение результатов.

Из "слабой" группы 23 сыворотки были подвергнуты однократной контрольной адсорбции пулом тромбоцитов от 100 человек; полученные результаты свелись к следующему: число сывороток, слабоположительных с Т-лимфоцитами, после адсорбции составляло 4 из 23 (17%); число активных анти-В-сывороток после адсорбции - 8 из 23 (34%); число "неопределенных" реакций на одну сыворотку - 2,4.

Таблица 30

Таким образом, результаты дробной и однократной контрольной адсорбции во многом совпали, что дает основание рекомендовать для группы "слабых" НLА-А,В,С-сывороюк тромбоцитарную адсорбцию пулом не менее чем от 75 - 100 индивидов.

Из группы "сильных" полиспецифических сывороток 15 образцов также анализировали с помощью ступенчатой адсорбции (табл. 31).

Как показал анализ, увеличение пула тромбоцитов снижало число ЛПК-реактивных сывороток после адсорбции. Однако даже пул тромбоцитов от 100 индивидуумов оказался недостаточным для реализации полной адсорбции, так как в этом случае 66% сывороток сохраняли анти-ЛПК-реактивность. Увеличение пула приводило вместе с тем к снижению общей контаминации сывороток НLА-А,В,С-антителами, а также к прогрессивному снижению сильных реакций на ЛПК. Выход В-активных сывороток практически оставался одинаковым при нарастании пула тромбоцитов, составляя 66%. "Засоренность" сыворотки слабыми реакциями не снижалась при расширении спектра тромбоцитов.

Таблица 31

Остальные 25 сывороток этой группы подверглись однократной контрольной адсорбции пулом тромбоцитов от 100 индивидуумов; при этом было получено некоторое снижение количества ЛПК-реактивных сывороток (14 из 25) по сравнению с результатами ступенчатой адсорбции и снижение контаминации слабыми реакциями.

Проведенное исследование показало, что при использовании для получения анти-В-реагентов сильных полиспецифических сывороток (если в этом возникает необходимость) следует проводить, адсорбцию тромбоцитами более чем от 100 индивидуумов, и повторять ее несколько раз.

Таким образом, исследование показало, что основными источниками анти-В-сывороток могут служить НLА-А,В,С-реактивные сыворотки со слабой и сильной активностью. Хотя "выход" активных анти-В-сывороток несколько больше в группе "сильных" HLA-сывороток, наиболее удобна для скрининга группа "слабых" HLA-сывороток, как так они лучше поддаются тромбоцитарной адсорбции и требуют более узкого спектра тромбоцитов - от 75 до 100 индивидуумов.

Скрининг сывороток на выявление HLA-DR-активности посредством обработки β²-микроглобулиновой сывороткой. Этот вид селекции анти-DR-сывороток пока не получил широкого признания, однако он считается перспективным. Поэтому мы приводим описание принципа этого вида отбора В-клеточных специализированных сывороток, направленных к локусу HLA-DR.

Два авторских коллектива [Bernoco D. et al., 1976; Goodfellow P. et al., 1975] предложили метод выявления В-клеточных: DR-антител, основанный на молекулярных различиях в строении- детерминант локусов HLA-A,B,C и DR. Как было показано выше, HLA-A,В,С-детерминанты представляют собой ассоциацию двух молекулярных компонентов - гликопротеида (мол. масса 45 тыс.) и β₂-микроглобулина (β₂m - мол. масса 12 тыс.), в то время как DR-детерминанты не ассоциировали с β₂m. После обработки В-клеточной суспензии β₂-микроглобулиновой антисывороткой А,В,С- детерминанты оказываются "заблокированными", а DR-детерминанты остаются свободными [Silver S. et al., 1979]. При первичном скрининге сыворотка, содержащая В-антитела, даже без предварительной адсорбции тромбоцитами, проявляет активность на: суспензии, обработанной анти-β₂-микроглобулиновой сывороткой [Richiardi P. et al., 1977; Majsky А., 1979].