3.3. Кросс-матч-серология

Определение наличия в крови преформированных антител, имеющих HLA-специфичность, получило название кросс-матч-реакции (перекрестная совместимость). Ранее это понятие включало только определение у реципиента преформированных антител, направленных к тканях конкретного донора. Сейчас различают специфический кросс-матч (наличие преформированных антител к конкретному донору) и неспецифический кросс-матч (наличие преформированных антител к клеткам 18 - 20 свободно выбранных индивидуумов, составляющих клеточную панель, желательно включающую все антигены сублокусов HLA-A, B).

Определение специфического кросс-матча сопровождает клиническую трансплантацию почки с момента рутинной реализации этой операции и до сих пор. Специфический положительный кросс-матч, определяемый по отношению к периферическим лимфоцитам или клеткам лимфатических узлов, всегда считался прямым противопоказанием к операции, поскольку, как правило, сопровождается острым отторжением трансплантата, нередко в хоДе операции (см. 3.2.1). Неспецифический положительный кросс-матч является важнейшей характеристикой исходного иммунологического статуса реципиента, которая обязательно включается в "лист ожидания" (см. главу 5). Он не является противопоказанием к трансплантации, однако пациенты, "насыщенные" HLA-антителами, требуют определенной тактики лечения в послеоперационном периоде.

3.3.1. Постановка кросс-матч-реакции

Специфический кросс-матч реализуется, как правило, на клетках лимфатических узлов, так как лимфоциты периферической крови донора, пребывающего долгое время в состоянии агонии, малопригодны для реакции; неспецифический кросс-матч реализуется на замороженных оттаянных лимфоцитах периферической крови. Пациентов трансплантологической клиники, находящихся на гемодиализе, проверяют на содержание преформированных антител не реже одного раза в 2 мес. В случае иммунизации гемотрансфузиями наибольшее накопление антител в крови обнаруживается на 8 - 10-й день после гемотрансфузии.

Описание методики:

- сыворотку реципиента порциями по 0,2 мл распределяют в конические пробирки для микробиологических исследований и помещают в холодильник (-20, -30°С); пробирки от каждого пациента маркируют таким образом, чтобы быстро найти; каждая пробирка может быть разморожена только один раз;

Схема 3

Раскапывание клеток и сыворотки при реализации неспецифического кросс-матча

- для реализации специфического кросс-матча используют клетки лимфатических узлов, транспортируемых в растворе Хенкса; сняв капсулу и фиксируя узел пинцетом, из него осторожно вымывают содержимое с помощью шприца (микроперфузии); концентрацию лимфоцитов доводят до 2 - 2,5 × 10⁶ в 1 мл; содержание мертвых клеток в суспензии не должно превышать 10%; в случае сильной контаминации другими клеточными элементами используют осаждение в фикол-верографиновом градиенте;

- при реализации неспецифического кросс-матча используют замороженные-оттаянные лимфоциты (см. 2.1.3) от 18 - 20 индивидуумов, которые размораживают и раскапывают (по 2 - 2,5 тыс. клеток) в 2 планшета по прилагаемой схеме (схема 3);

- размороженную после хранения сыворотку реципиентов раскапывают (1μl) в планшеты, где уже имеются тест-клетки; для учета эффекта антикомплементарности или эффекта "прозоны" сыворотки раститровывают, разводя инактивированной АВ-сывороткой, и используют разведения 1:1, 1:2 и 1:4;

- осуществляют обычный лимфоцитотоксический тест; сыворотка рассматривается как серопозитивная, если в двух из трех разведений имеет место положительная реакция - не менее чем 30%-е превышение над негативным контролем; последний должен содержать не более 30% мертвых клеток.

3.3.2. Респондеры и нереспондеры. Понятие о коэффициенте серопозитивности

Антитела к антигенам большого комплекса гистосовместимости человека не являются натуральными; они образуются в ответ на различные иммунизирующие воздействия, с которыми организм встречается в процессе жизнедеятельности.

Существует индивидуальная избирательность при различного рода иммунизации, выражающаяся в том, что определенная часть индивидуумов не образует антител к генетическим структурам HLA-комплекса, в то время как другие много и "охотно" отвечают антителообразованием на данный антигенный стимул. За индивидуумами, не образующими антител к HLA-А,В,С-антигенам, закрепилось название "нереспондеры" ("неотвечающие"), введенное G. Opeltz et al. (1973), а за теми, которые формируют HLA-антитела, - название "респондеры". Термины эти в определенной мере условны, так как нереспондеры могут образовывать антитела других классов, направленные как к локусу HLA-DR, так и к системам, расположенным вне HLA. Однако оно клинически удобно, позволяя емко характеризовать группу больных с определенным иммунологическим статусов.

Учитывая значительную роль, которая отводится сейчас HLA-антителам в выборе тактики лечения и прогнозировании состояния пациентов, мы провели определение фракции респондеров и нереспондеров при наиболее частых видах иммунизации - беременности и гемотрансфузиях.

В обследование поступило более 1400 сывороток от женщин, перенесших многократные беременности (3 - 12); сыворотки промялись на содержание антител к HLA-А,В,С-сублокусам на панели из 50 образцов ЛПК; "нулевыми" считались сыворотки, не реагировавшие ни с одним образцом панели.

Аналогичным образом были исследованы сыворотки будущих реципиентов-мужчин, иммунизированных многочисленными гемо-трансфузиями. Скринирование сывороток было проведено на панели криоконсервированных лимфоцитов от 20 здоровых неродственных лиц, подобранных специально на содержание антигенов сублокусов HLA-A,B,C. Сыворотка рассматривалась как не содержащая антител, если была активной не более чем в 5% клеточных образцов "криоконсервированной" панели. Результаты исследования представлены в табл. 37.

Таблица 37

Таким образом, около 60% индивидуумов являются нереспондерами по отношению к сенсибилизации HLA-А,В,С-антигенами, не отвечая на иммунизацию посредством беременности или гемотрансфузий.

Для характеристики респондеров или серопозитивных реципиентов нами обосновано введение в клиническую практику специального показателя, называемого коэффициентом серопозитивности (КС) [Зарецкая Ю. М. и др., 1978]. Он выражается в отношении числа клеточных образцов, положительно реагирующих с определенной сывороткой, к общему числу клеточных образцов в панели; КС = П_р/О_р, где П_р - число положительно реагирующих образцов; О_р - общее число клеточных образцов в панели.

Коэффициент серопозитивности выражают в процентах или долях единицы; при КС = 0,05 сыворотка рассматривается как серонегативная.

Биологический смысл КС состоит в том, что он характеризует насыщенность антителами сыворотки будущего реципиента, с одной стороны, и широту спектра антител - с другой.

Материалы, изложенные в разделах 3.2 и 3.3, дают возможность обосновать следующие практические положения:

- Т-позитивный кросс-матч, как специфический, так и неспецифический, является обстоятельством, отягощающим почечный прогноз; при этом специфический Т-позитивный кросс-матч есть абсолютное противопоказание к операции;

- наличие В-антител (В-позитивный кросс-матч, специфический л неспецифический) не отягощает прогноза аллогенного трансплантата (см. табл. 35) и пересадка в этом случае может быть произведена;

- для рутинной работы необязательно вводить какой-либо новый тип кросс-матча, кроме Т-клеточного, выполняемого на ЛПК;

- вследствие транзиторного характера HLA-А,В,С-антител и изменения их титра следует иметь несколько образцов сыворотки реципиента, взятых с интервалом 1 - 2 мес; наличие антител в одном из ранних образцов свидетельствует о пресенсибилизации в анамнезе к определенному антигену и является противопоказанием к пересадке в случае наличия этого антигена у донора;

- при реализации рутинного кросс-матча на клетках лимфатических узлов и селезенки, где содержание В-лимфоцитов выше, чем в периферической крови (25 - 40% против 5 - 20%), положительный кросс-матч, особенно выраженный слабой реакцией, может быть вызван наличием В-антител в сыворотке реципиента; если возникает необходимость постановки В-кросс-матча, то для этого может быть использована селезенка донора, без дальнейшего обогащения суспензии В-лимфоцитами.