1.7. Методическая революция 70-х годов

Современная молекулярная биология гена явилась результатом методической революции, которая за несколько лет полностью изменила лицо эксперимента. Хотя ключевыми здесь являются генная инженерия и секвенирование ДНК, другие методические подходы сыграли не меньшую роль. Чтобы сделать ясным дальнейшее изложение, кратко остановлюсь на этих основных методических подходах.

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот [34]. Если в 60-х годах разделение нуклеиновых кислот по молекулярным массам вели в основном путем ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, то в 70-х годах этот метод вытесняется методом электрофореза в геле. Впервые он был широко применен болгарским исследователем Р. Цаневым и сотр., и затем быстро завоевал общее признание. Оказалось, что в геле ДНК и РНК движутся тем быстрее, чем ниже их молекулярная масса. Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму молекулярной массы. Особенно важно, что разрешающая способность метода благодаря низкой диффузии гораздо выше, чем у ультрацентрифугирования. Для низкомолекулярных нуклеиновых кислот электрофорез ведется в полиакриламидном геле, для высокомолекулярных - в агарозном. Чем ниже концентрация геля, тем более высокомолекулярные нуклеиновые кислоты могут в нем разделяться. Подбирая условия, можно разделить как короткие олигонуклеотиды, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид, так и молекулы ДНК размером до нескольких миллионов пар нуклеотидов.

Расщепление ДНК рестриктазами [35]. В 1970 г. В. Арбер. (Швейцария) и Х. Смит (США) открыли рестриктазы - ферменты, с помощью которых бактерии расщепляют попавшую в них чужеродную ДНК. Эти эндонуклеазы узнают специфические последовательности ДНК и осуществляют по ним ее расщепление. Аналогичные последовательности в собственной ДНК не чувствительны к своей рестриктазе, так как они сразу после своего синтеза метилируются ферментом метилазой, узнающей те же самые последовательности. Рестриктазы II типа узнают обычно короткие палиндромы длиной 4-6 оснований. Например, популярная рестриктаза EcoRI узнает последовательность ^GAATTC/_CTTAAG, расщепляя ее между G и А. У разных видов бактерий рестриктазы различны, они узнают разные последовательности, и поэтому почти всегда можно подобрать фермент, расщепляющий исследуемую ДНК-Ферменты, узнающие гексануклеотиды, расщепляют ДНК на более длинные фрагменты, чем ферменты, узнающие тетрануклеотиды. Комбинируя обработку разными рестриктазами с последующим гель-электрофорезом, можно прокартировать изучаемый фрагмент ДНК, т. е. расположить по его длине места узнавания различными рестриктазами.

Блот-гибридизация [36]. ДНК, разделенную гель-электрофорезом, можно перенести с геля на нитроцеллюлозный фильтр. Для этого ее денатурируют в геле щелочью, нейтрализуют гель, и затем прикладывают к нему нитроцеллюлозный фильтр, обеспечивая медленный ток буфера через гель и фильтр. Денатурированная ДНК диффундирует и задерживается на фильтре, после нагревания которого в вакууме она "запекается" и иммобилизуется, т. е. обездвиживается на фильтре. Ее распределение на плоскости фильтра точно такое же, как и на плоскости геля. Однако в отличие от геля фильтр с ДНК можно использовать для последующей гибридизации с меченой пробой, т. е. с мечеными ДНК и РНК. Для этого инкубируют фильтр с раствором, содержащим меченую пробу, при повышенной температуре, затем тщательно отмывают его и, наконец, подвергают авторадиографии, т. е. выдерживают с рентгеновской фотопленкой. При проявлении последней на ней выявляются полосы, соответствующие полосам ДНК на фильтре, сгибридизо-вавшимся с радиоактивной пробой.

Процедура переноса ДНК с геля на фильтр обозначается английским термином blotting (промокание). Поэтому для таких фильтров с ДНК используется термин "блот" (blot). По имени автора Саузерна эти блоты называются "блотами Саузерна" (Southern blots).

Вместо ДНК можно перенести на фильтры с геля РНК. Такие фильтры называют Норзерн-фильтрами [игра слов: фамилия Саузерн означает "южный"; фильтры с ДНК по Саузерну - южные блоты; фильтры с РНК шутливо обозначили как северные блоты (Northern); фильтры с белками - как западные (Western)].

Получение высокомеченных проб [37]. Чтобы проводить гибридизацию с Саузерн- и Норзерн-фильтрами, содержащими весьма малые количества индивидуальных ДНК и РНК, были нужны очень высокомеченные пробы. Их научились делать путем энзиматического введения метки в выделенные препараты нуклеиновых кислот. Наиболее распространенный метод - это так называемая ник-трансляция (nicktranslation). ДНК инкубируют с двумя ферментами, ДНК-полимеразой I и ДНКазой I (последняя берется в ничтожных количествах вместе с высокомеченными предшественниками ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатами. ДНКаза вносит в двухцепочечную ДНК одноцепочечные разрывы. На эти места садится ДНК-полимераза и разрушает одну из цепей ДНК, одновременно заново ее застраивая, но используя при этом меченые предшественники. Таким образом, большая часть ДНК замещается радиоактивной, сохраняя при этом свою нуклеотидную последовательность. Есть и другие методы включения метки в ДНК и РНК.

Синтез ДНК по матрице РНК [38]. В 1972 г. Г. Темин и Д. Балтимор (США) открыли обратную транскриптазу, или ревертазу, - фермент, осуществляющий синтез ДНК по матрице РНК. Его выделили из очищенных ретровирусов. Ревертаза нашла широкое применение в молекулярной биологии, особенно для синтеза ДНК на матрице мРНК. Большинство мРНК несут на своем 3'-конце поли(А)-последовательность (50-100 нуклеотидов длиной). Используя олигоT(dT) - затравку, осуществляют с помощью ревертазы синтез цепи ДНК, комплементарной мРНК (кДНК), а затем достраивают вторую цепь либо с помощью той же ревертазы, либо с помощью ДНК-полимеразы I (работающей на матрице ДНК) - Можно получить и меченую кДНК, если использовать меченые дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Полная ДНК-копия с мРНК содержит, очевидно, всю информацию для синтеза белка, т. е. соответствует структурной части того или иного гена.

Молекулярное клонирование [34, 39]. Ключевым методом явилось молекулярное клонирование фрагментов ДНК, или генная инженерия в узком смысле слова. Этот метод, впервые описанный П. Бергом в США, позволяет нарабатывать большие количества любого отрезка ДНК, встраивая его в ДНК бактериальной плазмиды или бактериофага и заражая такой рекомбинантной ДНК бактерию-хозяина. Чаще всего в плазмиду или фаг встраивают либо фрагменты эукариотической геномной ДНК, либо кДНК, полученную в результате обратной транскрипции мРНК. Когда работают с плазмидами, то обычно используют такие, которые несут ген устойчивости к какому-либо антибиотику. В результате на среде с антибиотиком растут и дают колонии лишь те бактерии, в которые проникли рекомбинантные плазмиды. Когда работают с фагом, то следят за возникновением бляшек, т. е. очагов размножения фага, ведущего в лизису (разрушению) бактерий. Каждая колония или бляшка, полученная из одной исходной клетки, содержит один тип плазмиды или фага, включающий один и тот же фрагмент чужеродной ДНК. Рассевая далее такие колонии, получают чистый клон.

Одна из главных задач - поиск нужного клона. Если есть меченая "проба", например кДНК, синтезированная на мРНК, то нужный клон находят с помощью гибридизации с колониями. Делают отпечаток с чашки, на которой растут колонии, на нитроцеллюлозном фильтре. Затем проводят гибридизацию фильтра с меченой ДНК и выявляют колонии, связывающие меченую пробу. Эти колонии далее пересевают и получают клон, содержащий нужный ген. Есть и много других методов вылавливания нужных клонов из их множества, получаемого на первом этапе эксперимента.

Скоростные методы определения нуклеотидной последовательности ДНК^2* [40-45]. Следующим важнейшим прорывом явилось создание методов, позволяющих быстро определить нуклеотидную последовательность в ДНК. Первый, химический, метод заключается в том, что у гомогенной ДНК (полученной с помощью рестриктаз) метится один конец, а затем в четырех разных порциях меченой ДНК проводят частичное расщепление цепи по тому или иному нуклеотиду (A+G, G, Т+С, С). Затем разделяют каждую смесь с помощью высокоразрешающего электрофореза на дорожках одного и того же геля. Гели высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой, на которой после проявления виден набор полос, соответствующих фрагментам ДНК, начинающимся с меченого нуклеотида и обрывающимся на том или ином нуклеотиде (в зависимости от химической модификации). Таким образом, "с листа", содержащего четыре дорожки, можно прямо читать нуклеотидные последовательности. Идея метода была выдвинута в СССР С. К. Василенко и Е. Д. Свердловым, методы химических модификаций разработаны в значительной мере А. Д. Мирзабековым, работа над созданием общего метода начата им же вместе с У. Гилбертом, а полное завершение метода дано А. Максамом и У. Гилбертом в США.

Другой, энзиматический, метод был разработан Ф. Сэнгером в Великобритании. Исследуемый фрагмент ДНК при клонировании встраивается рядом с определенной последовательностью, к которой имеется комплементарная затравка. Используя такую затравку, ведут синтез ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы в присутствии меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Иногда вместо меченых предшественников используют меченую затравку. В результате происходит считывание исследуемого фрагмента. В реакционную смесь, разделенную на четыре порции, добавляют по одному из четырех дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов в каждую. Последние способны включаться в растущую ДНК, вставая на правильное место, но затем останавливают дальнейший рост ДНК, терминируют ее синтез. Опять-таки проводят разделение смеси образовавшихся цепей ДНК электрофорезом и затем авторадиографию. По четырем дорожкам читают нуклеотидную последовательность ДНК.

Многочисленные усовершенствования методов позволяют сегодня в относительно короткие временные интервалы расшифровывать последовательности ДНК длиной в десятки тысяч нуклеотидов.

Естественно, было разработано и много других важных методических подходов. С описанием некоторых из них мы встретимся ниже. Однако перечисленные выше сыграли решающую роль по крайней мере на первом этапе исследований. Они фактически вызвали революцию в молекулярной биологии гена эукариот.