18.02.2014

Найден ген, превращающий простые листья в сложные

Изучение мутантных растений, у которых вместо сложных листьев формируются простые, позволило генетикам из Великобритании, Германии и США частично расшифровать генетические основы эволюции формы листа. Ученым удалось превратить простые листья резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) в более сложные (лопастные), добавив в геном один-единственный ген RCO (REDUCED COMPLEXITY) сердечника шершавого (Cardamine hirsuta). Ген RCO экспрессируется в основаниях развивающихся выступов по краям зачатка листа и тормозит деление клеток в промежутках между выступами, что в итоге и делает лист лопастным или перистым. Ген RCO появился у крестоцветных в результате дупликации гена — регулятора развития цветов и листьев LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY 1). Ключевую роль в усложнении формы листа сыграли изменения регуляторной области гена RCO после дупликации. Ближайшие предки резуховидки Таля утратили ген RCO, а вместе с ним и сложные листья.

Расшифровать во всех деталях генетические основы эволюции сложного морфологического признака — задача крайне трудная даже на современном уровне развития науки. Каждый новый успех на этом пути — важное достижение, достойное освещения на страницах самых престижных научных журналов (и, конечно, на «Элементах»: см. ссылки в конце новости).

Международная команда генетиков сумела идентифицировать ген, сыгравший важную роль в эволюции формы листа у растений семейства капустных (или, как их называли раньше, крестоцветных). Главным объектом исследования был сердечник шершавый (Cardamine hirsuta). Лист у сердечника сложный, перистый, состоящий из нескольких боковых вторичных листочков и одного концевого (рис. 1, слева). Растения обрабатывали мутагенным веществом — этилметансульфонатом. У одного из полученных мутантов произошло радикальное упрощение формы листьев: вторичные листочки редуцировались до небольших выступов по краю основного листа и пары лопастей у основания (рис. 2). При этом число первичных листьев и их расположение остались прежними.

Генетический анализ показал, что мутация вывела из строя гомеобоксный ген, который авторы назвали REDUCED COMPLEXITY (RCO, а сама мутация обозначается как rco). Сравнив геномы разных видов крестоцветных, ученые выяснили, что ген RCO появился в результате удвоения (дупликации) гена LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY 1). Гены, родственные LMI1, еще на ранних этапах эволюции цветковых растений взяли на себя роль регуляторов развития цветков и листьев. В частности, LMI1 необходим для формирования листьев с зубчатым краем (Saddic et al., 2006. The LEAFY target LMI1 is a meristem identity regulator and acts together with LEAFY to regulate expression of CAULIFLOWER).

Дупликация, породившая ген RCO, произошла у общих предков резуховидки и сердечника (и многих других крестоцветных, включая капусту) еще до их расхождения, но уже после отделения базальных (примитивных) крестоцветных, таких как крылотычинник (Aethionema), для которого характерны простые овальные листья.

У модельного растения резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) листья простые, а ген RCO отсутствует. Однако у другого вида того же рода, Arabidopsis lyrata, ген RCO есть, а листья более сложные, лопастные. Вся совокупность морфологических и генетических данных говорит о том, что вид A. thaliana с простыми листьями и без гена RCO произошел от предков, у которых ген RCO был, а листья имели более сложное строение.

Таким образом, авторы получили веские основания предполагать, что усложнение листьев у крестоцветных было связано с приобретением гена RCO, а их последующее упрощение у A. thaliana — с его утратой.

Каким образом появление RCO могло привести к усложнению листьев? Изначально RCO был всего лишь дубликатом старого гена LMI1, но потом накопил отличия как в белок-кодирующей, так и в регуляторной области. Проще всего предположить, что всё дело в увеличении производства белка, кодируемого геном LMI1 и его дубликатом, а имеющиеся различия между LMI1 и RCO не имеют существенного значения. Авторы проверили эту гипотезу, создав трансгенные растения с дополнительными копиями гена LMI1 (включавшими как белок-кодирующую, так и регуляторную части гена). Это ничего не дало: ни у сердечника с мутацией rco, ни у резуховидки Таля после такой генетической модификации форма листьев не усложнилась. Значит, RCO — не просто дополнительная копия LMI1. Он обладает своей спецификой, которая может быть заключена как в строении кодируемого белка (то есть в белок-кодирующей части гена), так и в том, где и когда ген включается (что определяется строением его регуляторной области).

Авторы изучили работу регуляторных областей LMI1 и RCO в зачатках листьев сердечника и резуховидки. Для этого к изучаемой регуляторной области приделывали бактериальный ген, включение которого окрашивает клетки в голубой цвет (см. GUS reporter system). Оказалось, что области экспрессии, определяемые регуляторными областями двух генов, сильно различаются. LMI1 экспрессируется на концах будущих вторичных листочков, которые закладываются как небольшие выступы на краю развивающегося листа, а RCO — в основаниях этих выступов (рис. 3). При этом LMI1 экспрессируется также в зачатках цветов и прилистников, тогда как работа RCO приурочена исключительно к основаниям вторичных листочков сложного листа. Области экспрессии LMI1 похожи у разных крестоцветных, включая вышеупомянутый крылотычинник.

Таким образом, изменения регуляторного участка гена RCO, произошедшие после его появления, изменили область его экспрессии по сравнению с исходной (предковой), характерной для LMI1. Это согласуется с предположением о том, что RCO после дупликации приобрел новую функцию, то есть произошла нео-функционализация (см. новость Многофункциональные гены — основа для эволюционных новшеств, «Элементы», 30.06.2008).

Затем авторы проверили, влияют ли на новую функцию гена RCO особенности его белок-кодирующей части. Для этого они соединили кодирующую часть LMI1 с регуляторной частью RCO и вставили эту конструкцию в геном Cardamine hirsuta с мутацией rco. В результате простые листья растений-мутантов снова стали сложными. Это значит, что для формирования сложных листьев важны только особенности регуляторной части RCO. Белки, кодируемые генами RCO и LMI1, сами по себе остались взаимозаменимыми. Всё дело в приобретении геном RCO новой области экспрессии — в основаниях выступов листа, а не на их внешнем краю.

И вот пришло время решающего эксперимента. Если предположения авторов верны и листья у Arabidopsis thaliana упростились в связи с потерей гена RCO, то возвращение утраченного гена может привести к тому, что листья любимого цветочка генетиков снова усложнятся. Эксперимент был проведен и дал положительный результат (рис. 4).

Правда, листья у трансгенных A. thaliana не стали такими же сложными, как у C. hirsuta. Вторичные листочки не сформировались, вместо них получились лопасти. Очевидно, чтобы лопасти стали полноценными вторичными листочками с собственными черешками, кроме RCO нужно что-то еще: какие-то дополнительные генетические особенности, имеющиеся у сердечника и отсутствующие у резуховидки. Интересно, что точно такие же лопастные листья, как у трансгенных A. thaliana, характерны для другого представителя рода Arabidopsis — A. lyrata, в геноме которого сохранился ген RCO.

Дальнейшие опыты показали, что многие гомологи LMI1, взятые у разных представителей крестоцветных (и даже у некоторых других двудольных), вызывают формирование лопастных листьев у A. thaliana, если кодирующие участки этих генов объединить с регуляторным участком RCO. Это еще один довод в пользу того, что ключевое эволюционное новшество при формировании сложных листьев у крестоцветных состояло в изменении регуляторного участка RCO, тогда как свойства самих белков, кодируемых генами этого семейства, весьма консервативны.

Наконец, авторы попытались выяснить, каким образом RCO превращает простой лист с волнистым или зазубренным краем в лопастной или перистый. Для этого они сравнили динамику роста листовых зачатков у обычных растений C. hirsuta (с перистыми листьями) и у мутантов rco (с простыми листьями). В обоих случаях на краю листовой пластинки формируются небольшие округлые выступы, расположение которых контролируется гормоном ауксином. Концентрация ауксина максимальна на концах выступов. Распределение ауксина не различается у обычных растений и мутантов, а значит, RCO не влияет на это распределение (известно, что оно контролируется другими генами, такими как CUC и KNOX).

Дальнейший рост самих выступов протекает одинаково у обычных C. hirsuta и у мутантов rco. Однако в поведении клеток, расположенных в промежутках между выступами, наблюдаются контрастные различия. В норме у C. hirsuta эти клетки не делятся. Поэтому между растущими выступами формируются глубокие вырезы, а сами выступы в итоге становятся вторичными листочками. У мутантов rco клетки в промежутках между выступами активно делятся, поэтому край листового зачатка растет равномерно. В результате вместо перистого листа получается сплошная листовая пластинка с волнистым краем. Это значит, что ген RCO, экспрессирующийся в основаниях выступов, не столько ускоряет рост самих выступов, сколько подавляет деление клеток в промежутках между зонами своей экспрессии.

Таким образом, детали головоломки постепенно сложились в схему, показанную на рис. 5. Гены, родственные LMI1, скорее всего, начали служить ограничителями роста очень рано в эволюции цветковых растений. Например, известная мутация гороха tendril-less, при которой усики превращаются в листья, вызывается поломкой гена, гомологичного LMI1 (в норме этот ген ограничивает боковое разрастание усиков, не давая им превращаться в листья). К тому же авторы показали, что экспрессия LMI1 или RCO сразу во всех частях развивающегося растения приводит к резкому угнетению роста у A. thaliana.

У первых крестоцветных, унаследовавших LMI1 от своих предков и еще не имевших гена RCO, листья были простыми, как у крылотычинника (Aethionema). Затем произошла дупликация LMI1 с последующей нео-функционализацией одной из копий. Новая функция возникла благодаря изменению регуляторной части гена, что повлияло на область его экспрессии. Ген начал экспрессироваться в основаниях выступов развивающейся листовой пластинки. Это затормозило деление клеток в промежутках между выступами и привело к усложнению формы листа. В дальнейшем предки A. thaliana утратили RCO, что вызвало вторичное упрощение листа (как у C. hirsuta с мутацией rco). Однако в геноме A. thaliana сохранились все прочие необходимые компоненты программы развития сложного листа: не хватает лишь гена RCO (или любого похожего гена, управляемого регуляторной областью RCO). Если его искусственно вставить в геном A. thaliana, растение приобретает сложные лопастные листья, в точности как у родственного вида A. lyrata.

Скорее всего, тот же самый эффект мог быть достигнут и без генной дупликации — путем формирования в регуляторной области LMI1 новых энхансеров. Именно таким способом развивались узоры на крыльях дрозофил (см.: Генетические механизмы формирования сложных признаков постепенно проясняются, «Элементы», 14.04.2010). В обоих случаях ключевую роль сыграли изменения регуляторных, а не кодирующих участков генов. По-видимому, это самый типичный путь формирования новых морфологических признаков. Гены, регулирующие морфогенез, как правило, многофункциональны. Причина в том, что в ходе эволюции к ним очень легко «привешиваются» новые функции — ведь эти гены фактически являются профессиональными переключателями, которым все равно, что переключать. Многофункциональность (плейотропность) регуляторов морфогенеза накладывает жесткие ограничения на эволюцию их кодирующих частей, потому что такие изменения приводят к множественным последствиям, большинство из которых наверняка будут вредными. Обойти эту проблему позволяют изменения регуляторных участков генов-регуляторов. При этом формируются новые области экспрессии гена-регулятора, что позволяет создать новую функцию, не вредя старым.

Источник: Daniela Vlad, Daniel Kierzkowski, Madlen I. Rast, Francesco Vuolo, Raffaele Dello Ioio, Carla Galinha, Xiangchao Gan, Mohsen Hajheidari, Angela Hay, Richard S. Smith, Peter Huijser, C. Donovan Bailey, Miltos Tsiantis. Leaf Shape Evolution Through Duplication, Regulatory Diversification, and Loss of a Homeobox Gene // Science. 2014. V. 343. P. 780–783.

Александр Марков

Источники:

1. elementy.ru