15.06.2015

В бактерию без циркадных ритмов встроили «часы» от цианобактерии

Ученые снабдили молекулярными циркадными часами бактерию, у которой не было природных циркадных ритмов. К таким часам можно подключить любые гены, и их работа станет зависимой от времени суток. С помощью имплантации суточных часов можно будет лечить заболевания, связанные с расстройством циркадных ритмов, или наладить адресную доставку лекарств в пораженные ткани строго по расписанию.

Как правило, молекулярные циркадные часы (Circadian clock) живых клеток представляют собой систему генов, соединенных петлями обратной связи. В простейшем случае ген А активирует работу гена Б, а тот, в свою очередь, подавляет работу гена А. Из-за этого А перестает стимулировать активность Б, и тот замолкает, а А снова приступает к работе. Если выработка одного из генов зависит от уровня освещенности, то, ориентируясь по таким внутренним часам, клетки могут определять, какое сейчас время суток, и в соответствии с этим управлять разными процессами. Например, у растений днем и ночью происходят разные реакции фотосинтеза, а у животных ночью включается режим экономии, отдыха и очистки мозга от токсинов - режим сна.

Однако обнаружились и другие модели биологических часов - работающие без экспрессии генов. К таким часам относится природный осциллятор цианобактерий Synechococcus elongatus, подсказывающий, когда какие реакции фотосинтеза им надо проводить.

У цианобактерий внутренние часы работают так (рис. 1). Есть главный белок, KaiC, который способен сам на себя навешивать фосфат и сам с себя фосфаты удалять. В фосфорилированном состоянии он хорошо связывается с другим белком, SasA, который, служит посредником для запуска «дневных» процессов. Направляют фосфорилирование и дефосфорилирование KaiC два других белка - KaiA и KaiB. Первый из них стимулирует фосфорилирование KaiC, а второй - наоборот, удаление фосфата. У цианобактерий KaiA действует в основном на свету, а KaiB - в основном в темноте. Получается, что днем KaiC фосфорилирован, а ночью - лишен фосфатов. (Подробнее о работе внутренних часов цианобактерий см. в статье: M. Ishiura et al., 1998. Expression of a Gene Cluster kaiABC as a Circadian Feedback Process in Cyanobacteria.)

Интересно, что у вспомогательных белков KaiA и KaiB нет кофакторов, которые помогали бы им чувствовать свет, так что механизм переключения между этими двумя активаторами некоторое время оставался загадочным. Тем более интересно, что система могла работать и в изолированном от остальной клетки виде, в пробирке, где никакие фотосенсоры цианобактерии уж точно не могли ничего подсказать ей об условиях освещения. Оказалось, что периодичность работы системы регулируется соотношением АТФ и АДФ. Чтобы навесить на себя фосфат, KaiC забирает его у АТФ и расходует эти молекулы. Когда АТФ становится слишком мало, начинается обратный процесс - KaiC снимает с себя фосфаты и возвращает их на АДФ. По-видимому, белки-регуляторы ориентируются именно на то, сколько АТФ или АДФ находится в растворе.

Таким образом, чтобы сделать циркадные часы как у цианобактерий, нужны три белка, а также источник энергии - молекулы АТФ. Если смешать эти компоненты в пробирке, будет циклически изменяться фосфорилирование одного из белков, а период колебаний будет близок к суткам. Эта система напоминает биологический вариант реакции Белоусова - Жаботинского, в которой тоже происходят циклические превращения веществ. Конечно, такая система не полностью независима от работы генов: все-таки новые копии белков периодически нужно синтезировать. Но хотя бы относительная независимость от работы генов полезна, например, чтобы цикл жизни клетки не сбивался во время деления. При делении клетки ее ДНК должна реплицироваться, и этот процесс может временно нарушить работу «генетических» часов. А вот на колебания фосфорилирования белков никакие изменения состояния ДНК не повлияют.

Система цианобактерий такая простая и неприхотливая, и способна работать как минимум несколько суток даже в отсутствие работы генов, что у биоинженеров из Гарвардской медицинской школы (Бостон, США) возникла идея внедрить ее в какой-нибудь другой организм. В качестве объекта взяли самую популярную лабораторную бактерию - Escherichia coli, у которой нет собственных суточных ритмов. Исследователи ввели в эту бактерию гены трех белков - составляющих осциллятора и убедились, что уровень фосфорилирования KaiC продолжает колебаться с суточным периодом и в этом «неродном» организме.

Конечно, было интересно не просто запустить часы в другом организме, а научить их управлять работой генов. Получить циклические колебания белков, управляемые вживленными в бактерию «часами», биоинженеры смогли даже двумя способами.

Во-первых, можно использовать связывание фосфорилированного KaiC с белком SasA (рис. 2). На один из них навешивается субъединица РНК-полимеразы бактерий, а на другой - белок, который распознает определенную последовательность ДНК. Тот ген, перед которым есть такая последовательность, будет работать только в дневное время суток. Так можно регулировать по часам работу потенциально любых генов - если мы знаем белки, которые могут привлечь к ним полимеразу.

Другой способ - это использовать генетические конструкции с промоторами цианобактерии, которые регулируются этими молекулярными часами в естественных условиях. Для этого нужно скопировать у бактерии не только сам осциллятор, но и управляемые им нижестоящие элементы, в том числе те белки, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК и активируют работу близлежащих генов. Для этого нужно сделать генетические конструкции, в которых за таким специфическим ДНК-сайтом, отвечающим за работу часов цианобактерии, будет стоять ген, активность которого будет легко наблюдать. Например, ген флуоресцентного белка, который можно увидеть глазами.

Эта работа американских ученых очень интересна для будущих практических приложений. Замечательно не только то, что часы цианобактерий простые и относительно независимые от работы генов, но и то, что их период именно суточный. Так что в будущем такая система может пригодиться, чтобы стабилизировать циркадные ритмы живых организмов. Из-за нарушения суточных ритмов страдают не только путешественники после длительных перелетов. Оказывается, суточные ритмы сбиваются, например, у кишечной микробиоты, если ее хозяин нерегулярно питается. А страдания наших кишечных бактерий могут вылиться и в наши собственные страдания, потому что микробиом комплексным образом влияет на метаболизм.

Генетически модифицированные бактерии, снабженные часами, смогут поддерживать правильные суточные ритмы, какой бы образ жизни ни вел хозяин. Другие потенциальные области применения - доставка лекарств в определенное время дня, а также лечение болезней, связанных с нарушением циркадных ритмов. В общем, каждому живому организму - по хорошим часам!

Источник: A. H. Chen, D. Lubkowicz, V. Yeong, R. L. Chang & P. A. Silver. Transplantability of a circadian clock to a noncircadian organism // Science Advance. 2015. DOI: 10.1126/sciadv.1500358.

Юлия Кондратенко

Источники:

1. elementy.ru