1.4.2. Методы, основанные на эффекте дестабилизации хромосом

Среди плазмид, которыми можно трансформировать клетки дрожжей-сахаромицетов, есть так называемые эписомные, в состав которых, помимо бактериальной ДНК, входит дрожжевой ген-маркер и ДНК дрожжевой 2 мкм-плазмиды.Сочень низкой частотой такие плазмиды могут интегрироваться в хромосомы в результате одного акта рекомбинации по гомологичным последовательностям. Те хромосомы, в которые интегрировалась плазмида в диплоидах, оказываются чрезвычайно нестабильными, теряясь целиком или теряя фрагменты одного из плеч с частотой до 30 %. В результате рецессивные маркеры оппозитной хромосомы проявляются, выходя в гомо- или гемизиготное состояние. В то же время все остальные хромосомы набора ведут себя нормально, остаются стабильными. Обнаружение такого эффекта дестабилизации хромосом, в которые интегрировалась эписомная плазмида, позволило разработать два новых метода генетического картирования.

Первый метод решает задачу картирования клонированного гена [15]. Производят трансформацию соответствующих реципиентных клеток эписомной плазмидой, несущей клонированный ген. Отбирают интегранты. По крайней мере часть из них несет плазмиду в локусе того гена, местоположение которого хотят определить. Интегрант скрещивают с тестером или тестерами, несущими рецессивные маркеры во всех хромосомах. Полученные диплоиды рассевают и определяют, маркеры какой хромосомы выходят при митотических делениях в гомозиготу с повышенной частотой (в 10-100 раз). В той хромосоме, которая подверглась дестабилизации, очевидно, и располагается картируемый ген.

Второй метод предложен для картирования любых рецессивных мутаций с неизвестной локализацией. Для его реализации необходима коллекция тестеров, каждый из которых несет интегрированную плазмиду в одной из хромосом набора. Штамм с картируемой мутацией должен быть скрещен с 17 (по числу хромосом) такими тестерами. Полученные гибриды рассевают и определяют, какой из них проявляет нестабильность по изучаемой мутации. Мутация с повышенной частотой будет выходить в гомозиготу в том случае, когда гомологичная хромосома гибрида несет интегрированную плазмиду [1]. В настоящее время создана коллекция тестеров с интегрированными плазмидами в девяти разных хромосомах.

Методы трансформации рекомбинантными плазмидами сейчас разработаны для Sacch. cerevisiae, Schizosacch. pombe, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans. Очевидно, что по мере развития генетической инженерии грибов, в частности когда станет больше известно о поведении рекомбинантных ДНК в трансформированных клетках, появятся и новые методы картирования генов в хромосомах разных видов грибов, основанные на использовании искусственно сконструированных молекул ДНК.