Глава 3. Картирование генов бактерий

Бактерии - прокариотические микроорганизмы, генетический аппарат которых в основном представлен единственной кольцевой молекулой ДНК, образующей сложную структуру из множества суперспирализованных петель, удерживаемых в компактном состоянии с помощью молекул РНК и белков. Такая скрученная хромосома (folded chromosome), называемая еще ядерным тельцем, или нуклеоидом, связана с мембраной клетки, что является необходимым условием для начала репликации и сегрегации дочерних хромосом в процессе деления клетки. Кроме хромосомы, генетический материал у бактерий может быть представлен также эписомными элементами - профагами и плазмидами, наличие которых не обязательно и нежизненно важно для клетки.

Размер хромосомы бактерий по данным разных методов (генетического: размер трансдуцирующего фрагмента; физических: вискоэластометрический метод, скорость ренатурации, электронная микроскопия) составляет для Pseudomonas aeruginosa 2,1 ⋅ 10⁹ Д, для Escherichia coli К-12 - 2,8 ⋅ 10⁹, для Bacillus subtilis - 2,0 ⋅ 10⁹ - 2,6 ⋅ 10⁹ и для Streptomyces coelicolor - 4,7 ⋅ 10⁹ Д. Если исходить из среднего размера гена в 1500 пар нуклеотидов, то бактериальная хромосома может содержать около 3000 генов.

Число хромосом в одной клетке бактерий зависит от стадии развития и физиологических условий роста культуры. При выращивании культуры на богатой среде в условиях хорошей аэрации может быть несколько хромосом в одной клетке вследствие реинициации новых циклов репликации ДНК еще до деления клетки.

Число автономно реплицирующихся кольцевых молекул плазмид определяется системой контроля репликации. При наличии строгого контроля репликации число копий плазмид на одну хромосому невелико, а при ослабленном контроле репликации оно увеличивается на 1-2 порядка, достигая нескольких десятков и сотен копий.

Бактерии как объекты генетических исследований имеют ряд преимуществ перед высшими организмами: они гаплоидны, способны к быстрому и практически неограниченному размножению в довольно простых лабораторных условиях и обладают рядом относительно несложных признаков, удобных для количественного, биохимического и генетического анализов.

В отличие от эукариотических микроорганизмов бактерии обладают разнообразными способами передачи ДНК, ведущими к гетерозиготному состоянию клеток. Почти каждый новый вид микроорганизмов - это новая генетическая система, новый феномен со специфическими особенностями. Не все детали генетического анализа, тщательно разработанные на одной системе, например на Е. coli К-12, в одинаковой степени пригодны для изучения другой системы, например P. aeruginosa или S. coelicolor A3 (3). Следует, однако, отметить, что принципиальные положения или главные приемы, разработанные для классических объектов генетики бактерий, успешно используются для генетического изучения новых групп прокариотических микроорганизмов.

В мире бактерий существует три различных способа переноса генетического материала из одной клетки в другую - конъюгация, трансдукция и трансформация. В последнее время на высших организмах и бактериях успешно и эффективно разрабатывается искусственный способ объединения генетического материала разных клеток путем слияния и регенерации протопластов.

Важное значение для генетического анализа имеют две особенности генетической рекомбинации, обнаруженные у всех исследованных до сих пор бактерий. Первая особенность состоит в относительной редкости генетической рекомбинации в скрещиваемых бактериальных культурах, что, за редким исключением, требует применения селекции рекомбинантов из большой популяции клеток родительских типов. В качестве селектируемых маркеров используют удобные аллели родителей, обусловливающие независимость роста от определенного питательного вещества (прототрофность) или устойчивость к антибиотикам, ядам или вирулентным бактериофагам. Выделенные рекомбинанты затем могут быть классифицированы по отношению к неселективным маркерам путем высева на ряд диагностических сред с добавками факторов роста или отсутствием ингибиторов.

Вторая особенность генетической рекомбинации бактерий, наблюдаемая при каждом из известных в настоящее время способов передачи генетической информации - конъюгации, трансдукции и трансформации, заключается в образовании неполноценных зигот - меродиплоидов - вследствие неодинакового вклада обоих родителей. В то время как генетический материал материнской (реципиентной) клетки представлен в зиготе целой хромосомой, т. е. полным набором генов, материал отцовской (донорной) клетки - только фрагментом хромосомы или частью генома. Образование меродиплоидной зиготы у бактерий сказывается на результатах рекомбинации, обусловливая отсутствие рекомбинантов от единичного или нечетного числа кроссинговеров, так как жизнеспособные рекомбинанты возможны лишь при двойном или четном числе перекрестов между хромосомой реципиента и фрагментом ДНК донорной клетки. Это приводит к уменьшенному вдвое выходу рекомбинантов.

Вклад донора зависит от способа передачи генетического материала, выбора конкретной системы и метода анализа. При трансдукции размер фрагмента хромосомы донора четко ограничен объемом головки бактериофага, в которую может быть ошибочно упакована ДНК хозяина. Например, головка фага Р1 может нести в 2,5 раза больше ДНК, чем головка фага Р22, и в опытах по трансдукции может включать сегмент ДНК Е. coli, равный приблизительно 2,2 % генома клетки, в то время как при генерализованной трансдукции у Salmonella typhimurium фаг может переносить около 1% генома.

При трансформации длина переносимой молекулы ДНК донора очень коротка и зависит как от способа приготовления препарата ДНК, так и от специфики конкретной системы. Размер однонитевой ДНК, участвующей в синапсе при трансформации у В. subtilis, составляет в среднем около 2 МД (около 0,1 % хромосомы). Только при конъюгации размер гетерозиготной области может сильно колебаться и в редких случаях достигать размера полного генома.

Меродиплоидность накладывает определенные ограничения на обнаружение сцепления между генами с помощью измерения частот рекомбинации. Однако данное препятствие можно преодолеть путем применения количественных и качественных тестов сцепления, зависящих только от меродиплоидного состояния и не зависящих от частот рекомбинации между парой локусов. Примером может служить картирование по градиенту переноса маркеров или по времени их вхождения в реципиентную клетку.

Несмотря на перечисленные трудности генетической рекомбинации у бактерий, высокая разрешающая способность методов генетического анализа позволила к настоящему времени картировать с той или иной полнотой хромосомы многих видов бактерий и изучить тонкое строение и функцию отдельных генов.