3.1. Конъюгация

Конъюгация - способ передачи генетического материала путем соединения клеток противоположного пола - типа донора (мужских) и типа реципиента (женских), определяемый конъюгативными плазмидами. Последние могут автономно реплицироваться в цитоплазме или интегрироваться в бактериальную хромосому. В составе генома конъюгативной плазмиды имеется tra-оперон, гены которого осуществляют следующие функции: 1) синтез половых волосков донорной клетки, необходимых для осуществления контакта с реципиентной клеткой; 2) синтез веществ, сводящих к минимуму возможность спаривания между собой клеток донора; 3) конъюгативный перенос собственной плазмиды или хромосомной ДНК, начинающийся с определенного сайта; 4) вегетативную репликацию автономной плазмиды; 5) контроль числа копий плазмиды на хромосому; 6) контроль несовместимости родственных плазмид.

Конъюгативные плазмиды обнаружены как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. Среди них наиболее изучен половой фактор Е. coli К-12. Он существует в автономном состоянии в клетках F⁺ и в интегрированном состоянии - в клетках донора Hfr. Реципиентные клетки не содержат F-плазмиды и поэтому названы F^-. Доноры F⁺ переносят F-плазмиду весьма эффективно во все клетки F^-, а гены хромосомы - с очень низкой частотой (10^-5). Доноры Hfr переносят бактериальную хромосому с фиксированной точки (сайта интеграции плазмиды) ориентированным образом и с высокой частотой (10^-2-10^-3). Часть интегрированного F-фактора переносится последним как терминальный маркер и поэтому большинство клеток трансконъюгантов остается F^-. За 1 мин переносится приблизительно 26 ⋅ 10⁶ Д ДНК донора, а вся хромосома - за 100 мин.

Конъюгативные плазмиды и бактериальная хромосома содержат инсерционные последовательности (insertion sequence) - IS, в которых происходит редипрокная рекомбинация с образованием штаммов Hfr, характеризующихся разной локализацией начала и разным направлением переноса хромосомы. Генетическим методом идентифицировано около 25-30 сайтов интеграции F в хромосому. Большинство коньюгативных плазмид, выделенных из природных штаммов, содержат trа-опероны в репрессированном состоянии. Только одна из 1000 или 10 000 клеток имеет функционально активную конъюгативную плазмиду.

Некоторые конъюгативные плазмиды обеспечивают перенос ДНК при выращивании штаммов донора и реципиента в жидкой среде, другие плазмиды более эффективно переносят хромосому при скрещивании на агаризованной среде в чашках или при контакте клеток на мембранных фильтрах, лежащих на питательном агаре или залитых тонким слоем мягкого агара. После необходимого промежутка времени фильтры помещаются на селективный агар с целью контрселекции клеток донора. Кроме того, фильтры могут быть помещены в солевой буфер для приготовления суспензии клеток и их разобщения с помощью смесителя, соответствующего разведения и высева на селективные среды. Оптимальная температура для проявления половой функции конъюгативных плазмид бактерий семейства Enterobacteriaceae - 37 °С. Конъюгативные плазмиды группы IncH осуществляют оптимальный перенос генов при 25 °С.

Необходимо упомянуть еще об одном естественном барьере на пути переноса генетического материала у бактерий - наличии системы рестрикции, деградирующей вошедшую в клетку чужеродную ДНК. Выделены мутанты с дефектной системой рестрикции (hscLR, hsdS) у кишечной палочки, сальмонелл и других бактерий.

Перенос хромосомы от Е. coli Hfr в Е. coli F^-. Известно много штаммов Hfr с разными точками начала и направлениями переноса хромосомы (рис. 3.1). Для выбора соответствующего донора Hfr при картировании новых локусов необходима предварительная информация о той области хромосомы, в которой может располагаться исследуемый ген. Приблизительную локализацию ауксотрофных и условнолетальных мутаций можно быстро определить с помощью метода реплик и набора штаммов Hfr, точки начала переноса хромосомы которых разбросаны по всей карте. Штаммы HfrStr^s, выросшие в виде отдельных пятен, перепечатывают на газон реципиентных клеток F^-Str^r, которые несут исследуемую мутацию. Среда в чашке селективна для рекомбинантов, и последние вырастают на ней плотными пятнами только при наиболее тесном расположении точек начала переноса хромосомы к мутантному локусу. Можно использовать также альтернативный метод - перепечатку пятен разных мутантных штаммов (100 на чашку) на газон Hfr-штамма. Таким образом, более 1000 разных мутаций может быть картировано в одном опыте в течение нескольких дней [28].

Рис. 3.1. Карта координат точек начала переноса хромосомы некоторыми штаммами Hfr [11]. Части внутреннего кольца, отмеченные прерывистыми линиями, указывают на пробелы в трансдукционном сцеплении. Острие стрелки - точка начала переноса хромосомы Hfr - штаммами

Для иллюстрации метода скрещивания Hfr х F^- в качестве донора можно взять прототрофный штамм Hfr OR4λ^-, переносящий хромосому в направлении 0-thr-leu-proA-lac... от точки 0 и чувствительный к налидиксовой кислоте и стрептомицину, и полиауксотрофный штамм F^- ara-14 leu-6 proA70 1ас-41 purE42 λ-trpE38 nalA94 rpsL109 thi-1, недостаточный по лейцину, пролину, аденину, триптофану и тиамину и устойчивый к налидиксовой кислоте и стрептомицину.

Проверка стабильности фенотипа донора Hfr. Поскольку донорные штаммы характеризуются нестабильностью из-за возможной реверсии в F⁺ -форму, до начала скрещиваний прежде всего необходимо проверить принадлежность большинства клеток популяции донора к фенотипу Hfr с помощью метода отпечатков (перепечатка изолированных колоний Hfr на газон F^-leu-50 supE42, rpsL206, высеянный на минимальный агар, селективный для трансконъюгантов Leu+Strr). Густой рост рекомбинантов - доказательство стабильности фенотипа Hfr каждой колонии. При высокой частоте появления реверсий F⁺ из исходной матричной чашки донора можно выбрать отдельные колонии с фенотипом Hfr для дальнейших исследований.