3.1.1. Анализ времени переноса маркеров методом прерывания скрещивания

Клетки донора и реципиента (генотип, см. выше) выращивают в богатой жидкой среде (бульоне) в условиях аэрации на качалке до плотности 10⁸ в 1 мл для оптимального проявления донорного фенотипа. Культуры реципиента и донора смешивают в колбе в соотношении 10:1 при 37 °С и смесь слабо покачивают. Определяют титр клеток родителей. Через определенные интервалы времени, например через каждые 2, 3, 5 или 10 мин, из конъюгационной смеси отбирают пробы, разводят их десятикратно буферным раствором, содержащим налидиксовую кислоту, и инкубируют 30-40 мин при 37 °С, а затем высевают соответствующие разведения по 50 мкл на минимальные агаризованные среды, селективные в отношении трансконъюгантов Leu⁺, Nal^r, Pro+Nal^r, Ade+Nal^r, Trp+Nal^r и Thi+Nal^r. После инкубации чашек при 37 °С в течение 2 сут подсчитывают титры трансконъюгантов каждого типа для каждого промежутка времени прерывания по отношению к титру Hfr в начале скрещивания. Полученные данные можно представить графически с целью определения времени переноса каждого селектируемого маркера Hfr - донора (рис. 3.2).

Метод прерывания конъюгации пригоден для картирования мутаций, расположенных друг от друга на расстоянии не менее 1-2 мин. Генетическая карта, построенная с помощью данного метода, содержит 100 мин и хорошо согласуется с физическим распределением генов на кольцевой хромосоме.

Рис. 3.2. Кривые вхождения маркеров донора в прерываемых скрещиваниях штамма Hfr Str^S с реципиентом F^-Str^r Е. coli К-12 (29]: 1 - arg⁺ х 10; 2 - thr⁺ х 10; 3 - try⁺; 4 - his⁺. Рекомбинанты наследовали маркер Strr реципиента и один из нескольких маркеров Hfr. Плато - спонтанные разрывы хромосомы