4.1. Конъюгация

Подобно кишечной палочке и другим грамотрицательным микро-организмам конъюгационный перенос хромосомы с помощью половых факторов имеет место и у актиномицетов, хотя последние относятся к грамположительным бактериям и характеризуются некоторой спецификой полового процесса. Наиболее четко и всесторонне конъюгация изучена у Streptomyces coelicolor А3(2), являющегося классическим объектом генетики стрептомицетов. Плазмиды вообще и конъюгативные плазмиды в частности широко распространены среди разных видов и штаммов стрептомицетов, свежевыделенных из природных образцов или сохраняемых в музейных коллекциях. Размер плазмид и число копий на хромосому значительно варьируют. Они контролируют фертильность, образование антибиотиков и устойчивость к ним, дифференциацию (образование воздушного мицелия и спор), образование пигмента и другие признаки. Кроме плазмид, спаривание клеток (конъюгацию в широком смысле слова) могут контролировать также хромосомные гены, описанные у родококков и микобактерий [7].

Рассмотрим на примере S. coejicolor A3 (2) роль плазмид в определении фертильности скрещиваний штаммов. У штамма дикого типа (SCP1 + SCP2+ IF) в автономном состоянии находятся две половые плазмиды - SCP1 и SCP2, каждая из которых может подвергаться элиминации с частотой 0,03- 1,0 %. Штамм без одной плазмиды SCP1- SCP2+ является ультрафертильным реципиентом (UF) в скрещивании со штаммом нормальной фертильности (NF), в котором плазмида SCP1 находится в интегрированном состоянии. Скрещивания NF X UF впервые у прокариотов дают возможность проводить неселективный анализ рекомбинантов, частота которых достигает 100 %. Второй важной особенностью данного скрещивания является обязательный перенос донором небольшой части генома возле 9-часовой области карты, получившей название "необходимая область". В скрещивании NF X UF не наблюдается инфекционное превращение штаммов UF-типа в NF-тип независимо от рекомбинации хромосомных генов.

Для этого скрещивания характерен двунаправленный градиент частоты маркеров NF-типа, убывающий в обоих направлениях от 9-часовой области. На этом основании скрещивание NFxUF относится к числу поляризованных и асимметричных, т. е. имеется в виду перенос хромосомы только в одном направлении - от донора к реципиенту - и перенос не любого фрагмента хромосомы, а только определенного. Автономное состояние плазмиды SCP1 в штаммах SCP1+SCP2+ определяет IF-тип фертильности последних (от initial fertility - исходная фертильность штамма дикого типа). Штаммы NF-типа обнаружены в коллекции ауксотрофных мутантов и рекомбинантов и возникали случайно из IF-типа путем скрещиваний и мутагенеза, UF-штаммы также возникали из IF-типа спонтанно с частотой 0,03-0,4 %, которая под действием УФ- и Х-лучей может быть повышена до 1-2 %.

Различия между NF- и IF-типами проявляются главным образом в скрещивании с UF-штаммами. IF-штаммы в скрещивании с UF-тестором или между собой дают низкую частоту рекомбинации (около 10^-4). Скрещивания NF X UF ультрафертильны, а скрещивания NF X NF и NF X IF имеют среднюю фертильность. Плазмида SCP1 трансмиссибельна и с высокой частотой (53 %) переносится в реципиентные клетки. В скрещиваниях SCP1⁺ SCP2⁺ X SCP1- SCP2⁺ интенсивное превращение UF-типа в IF-тип начинается после 24 ч инкубации смешанной культуры, когда появляется воздушный мицелий, и полностью завершается ко времени образования спор.

Кроме доноров типов IF и NF, известны также новые типы донорных штаммов - так называемые штаммы SCP1 Под действием УФ-лучей на споры IF-штаммов частота появления новых доноров составляет 0,17 %. Они возникают в виде белых секторов колоний с лучше выраженной споруляцией. Почти все новые доноры нестабильны, выщепляют исходные типы IF и UF. Новые доноры эффективно передают маркеры в одном направлении по или против часовой стрелки от фиксированной точки на хромосоме. Согласно гипотезе Хопвуда и соавт. [14], плазмида SCP1 в новых донорах включала в свою ДНК немаркированный кусок хромосомы - начало фиксированного переноса. Замещенная плазмида SCP1 и хромосома обладают гомологичными участками, в которых может происходить кроссинговер с последующей мобилизацией хромосомы. Новые доноры с высокой частотой (иногда до 50 %) спонтанно теряют плазмиду и этим отличаются от IF-штаммов. Плазмида SCP2 - второй половой фактор S. coelicolor А3(2), однако она находится в репрессированном состоянии и кроссы SCP2⁺ X SCP2- низкофертильны. Дерепрессированный вариант плазмиды SCP2* повышает частоту рекомбинации в скрещивании со штаммами SCP2^- на три порядка без предпочтительной мобилизации специфической области хромосомы. Плазмида SCP2* инфекцйонно переносится в клетки реципиента в скрещивании SCP2* X SCP2^-. Доказательства интеграции плазмиды в хромосому не получены. Частоты рекомбинации по хромосомным маркерам с разной комбинацией автономных плазмид в штаммах приведены в табл. 4.1.

Таблица 4.1. Частота рекомбинации в скрещиваниях штаммов, содержащих плазмиды SCPl, SCP2 и SCP2* [6]

Даже при отсутствии обеих плазмид частота рекомбинации в скрещиваниях ауксотрофных штаммов составляет 10^-8. Приемлемого объяснения данного факта нет. Можно предположить наличие третьей, еще не открытой плазмиды или другого механизма конъюгации стрептомицетов, не зависящего от плазмид. Плазмиды SCP1 и SCP2 различаются между собой эффективностью скрещиваний. Механизм мобилизации хромосомы плазмидами не известен. Плазмида SCP1 может интегрироваться в хромосому, а SCP2 - нет. Кинетика переноса маркеров в скрещиваниях стрептомицетов трудно поддается изучению из-за мицелиального роста культур.

Характерным фенотипическим проявлением конъюгативных плазмид стрептомицетов является образование так называемых поков, или оспин (pock - оспина). В скрещиваниях SCP1⁺ X SCP1^- и SCP2* X SCP2^- наблюдается угнетение роста или гибель гиф реципиента, которое напоминает явление летального зигозиса, связанное с половой плазмидой кишечной палочки, и проявляется в виде узкой зоны отсутствия роста или споруляции культуры бесплазмидного штамма в месте контакта с мицелием плазмидсодержащего штамма. Для проявления летального зигозиса необходим непосредственный контакт гиф и перенос плазмиды. Штаммы tra^- не способны переносить плазмиду SCP1 и не образуют зоны подавления роста штамма SCP1^-. Поки являются удобным признаком для идентификации плазмид в генетических экспериментах со стрептомицетами. Они помогли обнаружить семью плазмид SLP1, образующихся у S. lividans после переноса хромосомы донора S. coelicolor A3 (2), разработать систему трансформации протопластов стрептомицетов с помощью плазмидной ДНК, установить межвидовой перенос плазмид SCP1 и SCP2* в S. lividans 66 и S. parvulus. Таким образом, поки являются доказательством присутствия любой конъюгативной плазмиды и могут использоваться в качестве одного из признаков вектора для отбора трансформантов при клонировании генов.

Плазмида SCP1 трудно выделяется из мицелия, имеет молекулярную массу около 150 тпн и кодирует биосинтез антибиотика метиленомицина А. Плазмиды SCP2 и SCP2* не отличаются между собой структурой, имеют молекулярную массу 31 тпн и представлены небольшим числом копий на хромосому (от одной до пяти). SCP2* была искусственно уменьшена до 15 тпн с сохранением всех основных свойств, за исключением стабильности. Еще меньших размеров плазмиды (9-10 тпн) способны переносить фрагменты хромосомы хозяина, что отличает их от F-плазмиды Е. coli К-12 и свидетельствует о сравнительно простом способе конъюгативного переноса хромосомы у стрептомицетов. Плазмида SCP2 использована для конструирования векторов и клонирования генов.