5.1. Физическое картирование плазмид

5.1.1. Гетеродуплексный анализ

Все плазмиды в зависимости от их способности к собственному переносу в другие клетки делятся на две группы - конъюгативные и неконъюгативные. В свою очередь, конъюгативные плазмиды классифицируют по группам несовместимости. Плазмиды одной группы несовместимости близкородственны и имеют тесносвязанные механизмы регуляции числа копий в клетке на уровне репликации ДНК. Важным критерием родства плазмид является сходство или степень гомологии их нуклеотидных последовательностей, которое можно выявить методами молекулярной гибридизации и электронной микроскопии гетеродуплексов. Первый метод не дает возможности обнаружить конкретные участки молекул ДНК плазмид, которые гомологичны друг другу. Гетеродуплексный анализ предусматривает денатурацию сравниваемых молекул ДНК щелочью, нейтрализацию последней и ренатурацию ДНК в формамиде при комнатной температуре с последующим удалением формамида диализом при 4 °С и нанесением гетеродуплексных молекул ДНК на сетку для электронной микроскопии. В качестве внутреннего стандарта можно использовать одноцепочечные молекулы ДНК фага ФХ 174. На электронограммах хорошо заметны двух- и одноцепочечные участки в гетеродуплексной молекуле. При отсутствии гомологии или аналогичного участка (при делении или вставке) образуются одноцепочечные петли замещения, или I-D-петли (вставки-делеции размером не менее 50 оснований).

Метод гетеродуплексного анализа применяют для определения областей гомологии любых плазмид. Он использован, например, для выяснения гомологии факторов F, Col V-K94, Rl, R6-5 и R100. Установлено, что половой, колициногенный и факторы лекарственной устойчивости имеют гомологию в области оперона tra, которая занимает в F-факторе около 44 % длины молекулы, т. е. почти всю ее левую половину на карте (между 49,6 и 3 тпн по часовой стрелке). Все три фактора R в основном по всей длине ДНК гомологичны, что указывает на их происхождение от общего предка, несмотря на выделение в лабораториях разных стран мира - Англии, ФРГ и Японии. Метод гетеродуплексного анализа применялся также для определения областей гомологии фактора F и F' gal, установления группы родственных плазмид, обусловливающих устойчивость к стрептомицину и сульфаниламидам микроорганизмов разных видов и родов. Данный метод использован для картирования генов переноса F-фактора и детерминантов устойчивости R-факторов [1]. Он является основным методом для исследования структурных изменений плазмид, выявления в них IS-элементов и транспозонов по характерным петлям, образованным инвертированными повторами. Половой фактор содержит четыре IS-элемента - по одному IS2 и два IS3. Указанные элементы участвуют в рекомбинационных событиях.