5.1.2. Рестрикционный анализ

Для физического картирования плазмид, вирусов и клонированных генов хромосом широко используют ферменты рестрикции (эндонуклеазы), которые узнают в ДНК специфические последовательности различной длины (табл. 5.1). На основании физических карт можно построить генетические карты, связав с конкретным участком ДНК определенную функцию путем сравнительного изучения делеционных или инсерционных мутантов и исходных плазмид. Кроме того, функцию определенной области ДНК плазмиды можно установить с помощью клонирования фрагмента и его использования для комплементации соответствующих мутаций, изучения списываемой с него информационной РНК и белков-продуктов. Для определения места и ориентации фрагментов на карте плазмиды, или, другими словами, для идентификации сайтов рестрикции, используют двойное или частичное расщепление ДНК интактной плазмиды и полученных от нее делеционных мутантов. После переваривания ДНК рестриктазами число и размер образовавшихся фрагментов определяют с помощью электрофореза образцов в агарозном геле. С целью идентификации цистронов такие фрагменты ДНК можно затем элюировать из геля и использовать после очистки для гетеродуплексного анализа, трансформации, сплайсинга генов, блотинга по Саузерну и т. д. Расщепление плазмиды двумя рестриктазами можно осуществлять одновременно или последовательно, т. е. после электрофоретического разделения и выделения фрагментов, полученных после действия одной рестриктазы. Для облегчения анализа данных используют программы и компьютеры.

Таблица 5.1. Ферменты рестрикции [3]

¹ (Низкая ионная сила буфера (мМ): Трис-HCl (рН 7,5) - 10,0; MgCl2 - 10,0: дитиотреитол - 1,0; средняя ионная сила буфера (мМ): NaCl - 50,0; Трис-HCl (рН 7,5) - 10,0; MgCl2 - 10,0; дитиотреитол - 1,0; высокая ионная сила буфера (мМ): NaCl - 100,0; Трис-HCl (рН 7,5) - 50,0; MgCl2 - 10,0; дитиотреитол - 1,0.)

² (Концы. образованные данными ферментами, могут быть сшиты с концами, полученными с помощью ферментов первого столбца.)

³ (Ферменты расщепляют вырожденные последовательности ДНК и образуют фрагменты с различающимися концевыми последовательностями, которые могут сшиваться только в некоторых комбинациях.)

⁴ (Любые тупые концы можно сшивать друг с другом.)