5.2. Генетическое картирование

Метод генетического анализа результатов скрещивания для определения сцепления генов мало приемлем для картирования плазмид. Здесь основными генетическими методами являются комплементационный анализ и картирование с помощью делений, которые успешно были применены для построения карт полового фактора и плазмид лекарственной устойчивости. Главное препятствие на пути генетического анализа - несовместимость плазмид, которая исключает применение цис-транс-тестов для отнесения мутаций к одному или разным цистронам. Однако эту трудность можно преодолеть с помощью остроумных экспериментов для анализа системы переноса половой плазмиды. Под действием мутагенных факторов у плазмид F'lac и F'gal получена большая серия точечных мутантов tra^-, классифицированных с помощью набора штаммов-супрессоров на типы сдвига рамки считывания, амбер, охра, UGA и несупрессибельные. Для объединения в одной клетке двух F'-факторов путем скрещивания двух штаммов F' у одного из них были приготовлены клетки F^- - фенокопии при разных режимах выращивания культур по отношению к аэрации при 42° С. Гетерогеноты F'/F' можно идентифицировать на среде с лактозой и тетразолием в виде колоний с секторами Lac⁺/Lac^-. Таким образом можно получить гетерогеноты F'/F', в которых еще до исключения одной несовместимой плазмиды произойдет экспрессия генов tra^-, что даст возможность применить тест цис-транс. Если две точечные мутации tra^- способны к комплементации, то гетерогенота F'/F' способна в течение 45-50 мин переносить, ту или иную половую плазмиду в новую реципиентную клетку.

Таблица 5.2. Конъюгационная комплементация мутаций tra [7]

Рис. 5.1. Карта цистрона tra штамма Hfr KI1000, построенная по результатам комплементации между точечными мутантами F lac tra^- и делеционными мутантами К11000 [7]. Линии и числа внизу карты - протяженность делеций разных мутантов KI; расстояния на карте изображены произвольно

Схема опыта следующая. Штаммы донора F' lac tra^- T6^SSu⁺ (фенотип Tra⁺ в результате супрессии нонсенс мутации tra^-)ск скрещивают с F^- - фенокопиями реципиента F- lac- tra- Т6 Spcs Su- и через 45 мин смесь обрабатывают лизатом Т6 с высоким титром фага для убийства клеток донора. Затем клетки реципиента, устойчивые к фагу Т6, испытывают на донорную способность (т. е. на наличие комплементации мутаций tra) в скрещивании со вторым реципиентом F^- lac^- Т6^r Spc^r, устойчивым к фагу Т6 и антибиотику спектиномицину (Spc^r в настоящее время обозначается rpsE) и не способным использовать лактозу в качестве источника углерода. Через 45 мин скрещивания клетки разобщают и высевают на среду без лактозы, содержащую спектиномицин, для отбора клеток Lac⁺ Spc^r, которые приобрели F'lac исходного штамма. Положительные результаты указывают на комплементацию между двумя F'tra^- плазмидами или на рекомбинацию между ними. Эти две возможности можно легко дифференцировать по способности к дальнейшему переносу плазмиды F' от клеток Lac⁺ Spc^r в клетки F^-. При комплементации мутаций tra^- перенос невозможен, а при возникновении рекомбинантов tra⁺ повторный перенос неограничен во времени.

Тест на комплементацию двух trа^- -мутаций можно также проводить с помощью Р1-трансдукции. Для приготовления лизатов экспоненциальные культуры мутантов F lac tra^- обрабатывали фагом Р1. С помощью конъюгационного и трансдукционного тестов комплементации на первом этапе исследований все мутации tra^- были классифицированы и отнесены к 11 цистронам tra [5, 9].

Следующий этап генетического анализа системы переноса полового фактора состоял в картировании генов tra с помощью делеционного анализа. Для получения делеций был сконструирован штамм HfrKl 1000 путем интеграции в оперон gal Е. coli К-12 плазмиды F ts 114 lac с мутантным геном репликации и последующей лизогенизации клеток термоиндуцибельным фагом, включившимся рядом с сайтом att. Штамм HfrKl 1000 переносит область рrоС как ранний маркер, a bio и lac - как терминальные маркеры. Когда данный штамм выращивают при 42 °С, индуцируется профаг CI 857 susP3 int-6, убивающий клетки хозяина без образования свободного фага и нормального вырезания профага из хромосомы. Выживают только спонтанные температуроустойчивые мутанты, потерявшие активность гена N профага в результате делеций. Один конец делеций захватывает весь или часть фага лямбда, а другой - интегрированный F lac. Серию делеционных мутантов tra^- анализировали с помощью комплементационного теста в конъюгационных и трансдукционных скрещиваниях с набором точечных мутантов F lac tra^- из 11 комплементирующих групп. Схема опытов аналогична ранее описанной.

С помощью метода конъюгационной комплементации определен порядок 9 генов tra (табл. 5.2). Метод трансдукционной комплементации подтвердил эти результаты и дал возможность локализовать дополнительно гены tral и traK (рис. 5.1). Таким образом, на основании результатов делеционного картирования установлена локализация на генетической карте F-плазмиды 11 генов переноса. К настоящему времени картирован ряд новых генов оперона traY - Z: traM, traY, traL, traP, traV, traW, trail, traN, traQ, traZ.