Под неоднозначностью трансляции понимают, с одной стороны, случаи, когда различные тРНК, переносящие одну и ту же аминокислоту, встраивают ее в места на иРНК, не соответствующие ей, т. е. каждая из этих тРНК может узнавать более чем один триплет. С другой стороны, антибиотик стрептомицин, связываясь с субчастицей 30S, может вызывать ошибки трансляции. Например, некоторые мутанты Е. coli, ауксотрофные по аргинину, несущие нонсенс-мутации гена орнитинтранскарбамилазы, могут расти на среде без аргинина, но со стрептомицином. По предположению Крика, эти случаи объясняются тем, что при взаимодействии между иРНК и тРНК на рибосоме только первые два основания обязательно должны образовывать комплементарные пары оснований кодона и антикодона. Третий же нуклеотид кодона может образовать пару с более чем одним основанием антикодона, что приводит к появлению необычных пар нуклеотидов (Г - У, И - У, И - А, где И - инозиновая кислота).
На неоднозначность трансляции влияет состояние белков S2 и S4, входящих в состав 30S рибосом. Мутации устойчивости к стрептомицину могут нейтрализовать неоднозначность трансляции.