Создатели химер

Как это делается?

Вся история генетики - это величайший пример единства науки и практики. Мы уже не раз говорили об этом. Однако в наши дни ученые вплотную подошли к решению еще более важной проблемы, которая ставит целый ряд крупнейших мировоззренческих вопросов. Я имею в виду исследования по генетической инженерии.

Созданы и продолжают совершенствоваться методы генной, хромосомной и клеточной инженерии, позволяющие принципиально по-новому решать многие коренные задачи сельского хозяйства, медицины и микробиологической промышленности. И то, что еще совсем недавно многим казалось чуть ли не фантастикой, становится реальным повседневным делом.

Сочетание слов "инженерия" и "генетика" показывает, что наконец-то сбылась мечта ученых и наступает время, когда биолог, подобно творцу новой техники, сможет конструировать идеальную биологическую модель, а затем воплощать ее в реальность, целенаправленно создавая любой живой организм с заранее заданными свойствами.

Различные генно-инженерные манипулирования на уровне молекул и генов, с одной стороны, могут быть уже сегодня осуществлены на организмах любой степени сложности, а с другой - ученые должны учитывать и эволюционную иерархию. Это-то и является причиной того, что основные успехи пока достигнуты лишь на уровне бактерий и фагов.

Генетическая инженерия - детище самых последних лет, но, как и каждая новая научная дисциплина, она не возникла из ничего, истоки ее - в достижениях прошлого. От всего, что делалось в этом направлении ранее, генетическая инженерия отличается в первую очередь тем, что формирует такие особенности генетического аппарата клетки, которые дают возможность воплотить в жизнь задуманные заранее логические модели.

Одна из первых работ в этом направлении проведена еще в 1934 году. По созданной логической модели, с помощью рентгеновских лучей, была преобразована видовая характеристика ядра все у той же плодовой мушки - дрозофилы. Оно содержит четыре пары хромосом, и изменение их числа происходит в природе в результате естественных внешних воздействий в течение сотен и тысяч лет. А ведь эти изменения как раз и связаны с появлением новых видов. Нам же удалось создать дрозофил с тремя и с пятью парами хромосом.

После этого в целом ряде случаев были продемонстрированы возможности целенаправленных перемен в структуре генетического аппарата. Так, например, в 1956 году американский ученый Е. Сирс перенес с помощью рентгеновских лучей кусочек хромосомы дикого злака эгилопса в хромосому пшеницы, обеспечив тем самым наличие у пшеницы той степени устойчивости к листовой ржавчине, которая свойственна "дикарю".

Конечно, подобная работа велась и ведется селекционерами. Однако в наше время открылись такие способы воздействия на молекулярные структуры наследственности, что ученые с полным основанием могут говорить уже не о селекции, а о генетической инженерии.

Предметом исследования генетической инженерии является как организм в целом, так и его молекулярный уровень, когда дело касается отдельных молекул, а также хромосомный, клеточный, тканевой, организменный и популяционный уровни.

То есть ее методы позволяют видоизменять организмы путем манипуляций с целыми клетками, их ядрами, хромосомами, участками хромосом, генами и частями генов. Наиболее перспективны молекулярные подходы, однако много обещают и другие возможности генетической инженерии.

Большое впечатление в 1970 году произвели работы индийского ученого Х. Г. Корана по химическому синтезу гена - они открыли перспективу перекинуть мост между живым и неживым. Химическим путем был создан короткий ген, состоящий из семидесяти семи нуклеотидов, имеющийся в клетках пекарских дрожжей. Средний же размер обычного гена в пятнадцать- двадцать раз больше 1000 - 1509 нуклеотидов.

Затем X. Г. Корана и его сотрудники осуществили синтез кодирующего тирозин гена, состоящего уже из 126 нуклеотидов.

Но искусственные гены Корана были не способны синтезировать необходимые вещества белковой природы. Объясняется это тем, что в природном гене, помимо его структурных частей, есть точки отсчета начала и конца синтеза. Таких точек отсчета в данных химически синтезированных генах не было. В 1970 году ученые обнаружили фермент, под действием которого происходит транскрипция с матриц и-РНК на молекулы ДНК, и назвали его обратной транскриптазой. Как известно, до того времени было принято считать, что генетическая информация может копироваться только в одном направлении - с ДНК на и-РНК.

Открытие фермента обратной транскриптазы позволяло надеяться, что если будут выделены в пробирке молекулы и-РНК, принадлежащие определенному гену, то этот ген может быть ферментативно синтезирован путем его транскрибирования с молекул и-РНК. В принципе это относится к любому из генов любого организма. Процесс ферментативного синтеза - сложный, многоступенчатый. Однако уже за период 1972 - 1973 годов были ферментативно синтезированы отдельные гены человека, кролика, мыши, голубя, утки, а также гены белка хрусталика глаза и иммуноглобина. В 1973 году ферментативный синтез гена глобина кролика был осуществлен в Москве в Институте общей генетики АН СССР совместно с Институтом молекулярной биологии и генетики АН УССР. Ген глобина голубя был синтезирован и в Институте молекулярной биологии АН СССР.

Как же выделенный в пробирке ген можно внедрить в избранную клетку? Эта задача была решена с использованием особых молекул ДНК, имеющихся в клетках бактерий, или с помощью ДНК фагов.

В клетках бактерий основная, наследственная ДНК представлена в виде большой кольцевой молекулы, в которой имеются тысячи генов. Наряду с этим в их клетках иногда содержатся малые молекулы, также кольцевые, несущие по несколько генов, названных плазмидами. Из-за малого размера и способности проникать в другие клетки плазмиды приобрели значение главных "повозок", перевозящих чужеродный генный материал. Такие молекулы-"повозки" получили название векторов.

Излюбленным объектом работ по генетической инженерии стала бактерия "кишечная палочка", обычно обитающая в кишечнике человека и хорошо изученная в молекулярно-генетическом плане.

Работу по внедрению чужеродной ДНК начинают с выделения плазмид. Для этого клетки бактерий помещают в пробирку с лизирующим раствором. В этих условиях оболочки клеток растворяются, и молекулы ДНК оказываются освобожденными. С помощью ультрацентрифугирования ДНК плазмид отделяют от ДНК хромосом и затем на них воздействуют ферментами - рестриктазами. Фермент разрезает ДНК плазмид, причем на концах разреза он расщепляет двойную спираль молекулы таким образом, что ее концы имеют однонитчатые структуры. Такие концы получают в дальнейшем возможность слипаться с другими, аналогично расщепленными фрагментами. За эту особенность однонитчатые окончания в местах разреза названы липкими концами.

Образовавшиеся при разрезании, открытые ДНК плазмид смешивают в растворе с фрагментами ДНК, то есть генами, выделенными из чужеродных клеток бактерий, вирусов, растений или животных. Чужеродный фрагмент с двумя липкими концами внедряется в открытую разрезанную молекулу плазмиды и замыкает ее в кольцо. Так возникает комбинированная плазмида, состоящая из своей ДНК и из внедренного в нее чужеродного фрагмента ДНК. Такие комбинированные плазмиды содержат в себе генетическую информацию не только от бактерии, из которой они выделены, но и часть чужой информации. В плазмиду бактерии в принципе можно вставить ген любого организма - человека, крысы, лягушки...

Для того чтобы ввести комбинированную плазмиду в избранную клетку, их смесь помещают в холодный раствор хлористого кальция. При быстром нагревании оболочки клеток резко увеличивают свою проницаемость, что позволяет комбинированным плазмидам проникать в клетки и становиться частью их наследственного аппарата, а затем, при размножении, попадать во все последующие поколения клеток.