III.3.1. Анализ случайной выборки спор

Для количественного учета мейотического расщепления на случайной выборке спор в моногибридном скрещивании выделяют гаплоидные продукты мейоза (аскоспоры) в потомстве гибрида, полученного от скрещивания штаммов, различающихся по одному признаку (размер или форма колоний, окраска колоний, ауксотрофность по какому-либо фактору роста, устойчивость к антибиотику и др.). Для этого собирают споры, не загрязненные вегетативными гибридными клетками и клетками родительских форм.

Сбор проводят по-разному у разных организмов. Спорулирующую культуру дрожжей-сахаромицетов выдерживают в спирте определенной концентрации, который убивает вегетативные диплоидные клетки, где не произошло мейоза, оставляя живыми аскоспоры. После этого смесь центрифугируют, промывают водой, помещают в раствор фермента, растворяющего оболочку асков, и таким образом разъединяют споры.

У нейроспоры аскоспоры при созревании высыпаются из плодового тела. Для их сбора переворачивают чашку с культурой гриба, и споры высыпаются на крышку.

Отобранные споры после соответствующего разведения в жидкой среде высевают на чашки с полной средой, где подсчитывают колонии, различающиеся по фенотипу (например, по окраске или форме колоний), и определяют их соотношение. Если исходные штаммы различаются по какому-либо биохимическому признаку (ауксотрофны по одному фактору роста), то после посева спор на чашки с полной средой выросшие на ней колонии переносят методом отпечатков на полную и минимальную среду, которая в данном случае оказывается селективной - на ней не растут мутантные клетки. Подсчитав число колоний, выросших при пересеве на полной и минимальной средах, можно определить число мутантных колоний. Оно равно разнице между числом колоний, выросших на полной среде (нормальные+мутантные), и числом колоний, выросших на минимальной среде (нормальные); затем определяют соотношение нормальных и мутантных колоний, полученное в данном опыте.

Если родительские формы различаются по аллелям одного гена, например В и b, то гетерозигота после мейоза образует два типа спор - В и b - в равном количестве, и соотношение нормальных и мутантных колоний, выращенных из случайной выборки спор, должно быть в этом случае примерно 1:1. Если признак контролируется не одним, а большим числом генов, то наблюдается отклонение от этого расщепления, например 3:1. Если в потомстве аскоспор гибрида расщепление отсутствует, то можно предположить, что признак определяется цитоплазматическим фактором. Нетрудно заметить, что расщепления на случайной выборке аскоспор не отличаются от расщепления у высших эукариот в анализирующем скрещивании.