III.3.2. Тетрадный анализ

Поскольку аскоспоры в аске некоторое время сохраняются вместе, можно учесть расщепление в каждой четверке спор, образовавшихся после одного мейоза (или в четырех парах спор, если аски восьмиспоровые). Такой метод учета расщеплений называется тетрадным анализом.

Для разделения спор применяют микроманипулятор. Каждую из спор помещают на полную среду, на которой вырастают клоны любых генотипов. Клетки из клонов, выросших на полной среде, переносят на полную (п), минимальную (т) и селективные (с) среды и проводят учет расщеплений в каждой тетраде (октаде) спор. На дрожжах пересев проводят по определенному шаблону: на чашке в ряду представлено потомство одной тетрады, каждый штрих соответствует потомству одной споры - а, б, в, г (рис. III.9).

Рис. III.9. Шаблон для анализа тетрад у дрожжей, а, б, в, г - споры

Если происходит расщепление по одной аллельной паре (В-b), то соотношение аскоспор во всех асках должно быть 2В:2b (или 4В:4b, если аски восьмиядерные), что служит прямым доказательством закона чистоты гамет. В тетрадном анализе не сокращают коэффициенты, т. е. не пишут 1B:1b, так как такая запись означала бы, что из 4 (или 8) аскоспор проросло только 2. Отклонения в расщеплении при моногенном контроле, как правило, редки и могут быть связаны с конверсией гена. Появление значительного количества тетрад, имеющих отклонение от расщепления 2:2 по изучаемому признаку, например 4:0,3:1, говорит об участии в расщеплении более одного гена. Другие причины отклонений - хромосомные перестройки, анеуплоидия, снижают жизнеспособность аскоспор и тем самым также влияют на расщепление.

Одной из важных особенностей тетрадного анализа является возможность картирования центромеры, которая выступает в качестве генетического маркера.

В упорядоченных тетрадах это можно сделать на основе расщепления по одному гену, анализируя порядок расположения спор разного генотипа (например, В и Ь) в аске, извлекая их из него по порядку.

Так, у нейроспоры возможны два типа расхождения хромосом в мейозе, которые определяют порядок расположения спор в аске: расхождение в I делении мейоза (рIд) и во II делении мейоза (рIд). Если в мейозе в гетерозиготной клетке не происходит кроссинговера между центромерой и геном, например В, то расхождение аллелей (В-b) идет в I делении мейоза (рIд). Об этом будет свидетельствовать следующий порядок расположения спор в аске: BBBBbbbb или bbbbBBBB. Он зависит от ориентации хромосом бивалента в метафазе I деления (рис. III.10).

Рис. III.10. Расхождение аллелей в первом делении мейоза (рIд) у нейроспоры. 1, 2, 3, 4 - хроматиды. I, II - центромеры

Если в мейозе между геном и центромерой происходит кроссинговер, то расхождение аллелей осуществляется во втором делении мейоза (рIIд), о чем будет свидетельствовать другой порядок расположения спор в аске, который определяется ориентацией хромосом бивалента в метафазе I и ориентацией хроматид в метафазе II деления. Он может быть BBbbBBbb, bbBBbbBB, BBbbbbBB, bbBBBBbb (рис. III.11).

Рис. III.11. Расхождение аллелей во втором делении мейоза (рIIд) у нейроспоры

Таким образом, порядок расположения спор в асках нейроспоры позволяет выявить, в каких из них произошел кроссинговер между геном и центромерой, и вычислить расстояние между ними. Для этого подсчитывают число асков, в которых произошел кроссинговер (рПд), и определяют их долю (%) qpem всех проанализированных асков. Из рис. III.11 видно, что в каждом таком аске только половина спор является кроссоверными. Поэтому расстояние гена от центромеры определяют как 1/2 от доли крос-соверных асков.

Рассмотрим картирование центромеры на основании анализа порядка расположения спор в асках нейроспоры при изучении наследования окраски спор.

В скрещивании между штаммом нейроспоры, продуцирующим черные споры, со штаммом, продуцирующим споры рыжего цвета, в поколении гетерозиготы были обнаружены аски со следующим расположением спор.

Соотношение спор разной окраски в каждом аске - 4 черные : 4 рыжие, следовательно, различия между исходными штаммами обусловлены аллелями одного гена. Порядок расположения спор в 26 асках (8 + 6 + 5 + 7) свидетельствует о расхождении аллелей во втором делении, т. е. о прошедшем кроссинговере между геном и центромерой. Доля кроссоверных асков равна: ²⁶/₁₄₆×100 = 17,8%, расстояние гена от центромеры - 17, ⁸/₂ = 8,9%.

Картирование центромеры возможно и в неупорядоченных тетрадах, однако только при наличии не менее трех маркеров.

Таким образом, на случайной выборке спор, а также методом тетрадного анализа можно установить тип наследования (ядерное или внеядерное) и число генов, по которым идет расщепление. Тетрадный анализ упорядоченных тетрад позволяет картировать центромеру на основе анализа расщепления по одному гену.