VIII.2.2. Картирование метафазных хромосом

Благодаря разработке методов дифференциального окрашивания хромосом с помощью флуоресцентных красителей стало возможным четко идентифицировать нормальные хромосомы, а также хромосомы с аберрациями - делециями, транслокациями и пр., которые могут быть использованы как маркеры для цитологического картирования. Кроме того, маркерами могут служить хромосомы с хорошо выраженной вторичной перетяжкой или со спутниками. Наличие у особи изучаемого признака и какого-либо цитологического маркера свидетельствует о сцеплении признака с данным цитологическим маркером. Это позволяет определить не только группу сцепления, но в ряде случаев и местоположение гена в хромосоме, которое идентифицируется благодаря дифференциальной окраске.

Сопоставление генетических и цитологических карт дрозофилы показало, что порядок расположения генов на генетической карте, построенной на основе данных о частоте рекомбинации, и цитологической карте, отражающей реальную структуру хромосом, одинаков. Однако нет полного соответствия между ними, особенно в прицентромерных районах: некоторые гены, тесно сцепленные на генетической карте, оказываются на цитологической карте на большом расстоянии друг от друга. Это можно объяснить тем, что в некоторых участках хромосом рекомбинация происходит чаще, чем в других, вследствие чего на генетической карте они занимают больше места, чем на цитологической.

Использование гибридизации соматических клеток в сочетании с новыми методами окраски хромосом и возможностью выявления в гибриде гомеологичных генов разных видов с помощью селективных методов значительно повысило эффективность цитологического картирования, так как анализ проводится на клонах, в которых имеется лишь одна или несколько хромосом одного вида. Этот метод применяется, в частности, для локализации генов человека.

По методу "стратегии дробления", основанному на получении большого числа хромосомных перестроек, нормальные клетки человека, у которых изучаемая хромосома маркирована уже установленными сцепленными генами, подвергаются облучению. Один из генов человека служит селектором для отбора гибридных клеток на определенной селективной среде. Облученные клетки затем гибридизуют с клетками мыши, дефектными по гену-селектору. Для роста на селективной среде гибридные клетки должны сохранять ген-селектор. Полученные клоны исследуют на присутствие остальных неселектируемых генов человека, локализованных в картируемой хромосоме. Если в гибриде присутствует интактная хромосома, то сохраняются все ферменты, контролируемые генами этой хромосомы. Если в результате делеции из этой хромосомы выпадает какой-либо ген, то на селективных средах обнаружится отсутствие соответствующего фермента. Понятно, что гены, локализованные на большом расстоянии от гена-селектора, будут утрачиваться чаще, чем гены, тесно сцепленные с ним. Очевидно также, что чем теснее сцеплены локализуемые гены между собой, тем чаще они будут утрачиваться (или сохраняться) вместе. Определяя частоты утрат пар маркеров, вычисляют расстояние между ними и порядок их расположения в хромосоме (рис. VIII. 5).

Рис. VIII.5. Картирование хромосом человека в гибридах соматических клеток методом 'стратегии дробления'. Гены ТК и ГК сцеплены между собой

С помощью этого метода Госс и Харрис (Goss, Harris, 1975) локализовали четыре гена в Х-хромосоме человека. Достоинствами метода является высокая разрешающая способность при картировании и независимость от кариологических характеристик. Его недостаток - зависимость от селективных систем и необходимость наличия уже локализованных генов.

Другой метод связан с использованием родительских клонов с хромосомными перестройками. Спонтанные хромосомные транслокации встречаются у человека достаточно часто. Уже идентифицировано более 300 реципрокных транслокаций человека и в США создан банк мутантных клонов с хромосомными аберрациями и биохимическими нарушениями, которые могут быть использованы для генетического картирования. Наиболее ценны для картирования клоны с транслокациями в хромосомах, несущих известные селективные локусы. Например, если в клоне, содержащем хромосому, возникшую в результате транслокации между аутосомой и длинным плечом Х-хромосомы, обнаруживаются три фермента, контролируемые генами Х-хромосомы, и один - контролируемый аутосомой, можно утверждать, что три гена локализованы в длинном плече Х-хромосомы, а один - в части аутосомы, вовлеченной в транслокацию (рис. VIII. 6).

Рис. VIII.6. Картирование хромосом человека с помощью метода соматической гибридизации с использованием транслокаций и делений. ФГК - фосфоглицерокиназа, ГФРТ - гипоксантингуанин-фосфорибозил трансфераза, ГФД - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, контролируются генами, локализованными в Х-хромосоме; НФ - нуклеозидфосфорилаза - контролируется геном 14-й хромосомы. + активность фермента, - отсутствие фермента

Более точную локализацию этих генов в длинном плече Х-хромосомы можно провести, вызывая фрагментацию Х-хромосомы, например делеции, в ее длинном плече. Сопоставляя совпадение между утратой фермента и определенных участков делетирован-ной Х-хромосомы, можно определить, в каких районах локализованы эти гены (рис. VIII. 7). На рис. показаны три гена, контролирующие синтез ФГК, ГФРТ и ГФД, локализованные в разных участках длинного плеча Х-хромосомы. Ген, контролирующий NP-фермент (нуклеозидфосфорилаза) локализован в транслоцированном на Х-хромосому участке 14-й хромосомы. Очевидно, что все четыре гена должны быть синтенными.

Рис. VIII.7. Локализация генов в длинном плече Х-хромосомы с помощью делений

С помощью метода гибридизации соматических клеток картируют хромосомы многих видов - человека, обезьяны, мыши, китайского хомячка и др. Недостаток метода заключается в невозможности картирования генов, не экспрессирующих в гибридных клетках; применение молекулярно-генетических методов позволяет его преодолеть.