VIII.3. Картирование хромосом с помощью гибридизации in situ клонированных нуклеотидных последовательностей

С разработкой методов генетической инженерии стало возможным получать препараты индивидуальных нуклеотидных последовательностей, что и легло в основу цитологического картирования хромосом с помощью гибридизации in situ. Оно впервые было использовано для локализации сателлитной ДНК на хромосомах Xenopus (Goll, 1968).

При гибридизации in situ клонированный ДНК-зонд, комплементарный картируемому участку, метят радиоактивной меткой, денатурируют и гибридизуют на препарате с клетками на стадии метафазы митоза, где хромосомы хорошо идентифицируются (или на препарате политенных хромосом). Образуется гибрид между фрагментом ДНК и комплементарным ему участком ДНК хромосом. С помощью авторадиографии и последующего дифференциального окрашивания на препарате можно увидеть, с каким участком (или участками) хромосом гибридизовался данный зонд.

Рис. VIII.8. Локализация мМГМ в политенных хромосомах дрозофилы методом гибридизации нуклеиновых кислот in situ указана стрелками

На политенных хромосомах достаточно просто локализовать как повторяющиеся (см. рис. VIII. 8), так и уникальные последовательности ДНК. Однако картирование уникальных генов с помощью гибридизации in situ мало эффективно на метафазных хромосомах, так как требует анализа большого числа метафаз, в которых суммируют число восстановленных зерен серебра над каждой хромосомой. Поэтому картирование в данном случае проводят с помощью методов клеточной и генной инженерии, для чего используют гибридные клетки (например, человек×мышь), сохранивших только одну из хромосом человека. Из разных клонов выделяют ДНК и обрабатывают ее рестриктазами. Полученные фрагменты ДНК разделяют гель-электрофорезом, а затем переносят из геля на нейлоновый фильтр, где и гибридизуют с меченным ДНК-зондом, соответствующим картируемому гену (блот-гибридизация, по Саузерну) (рис. VIII. 9). Обнаружение позитивного сигнала - полосы на электрофореграмме в одном из клонов, содержащих определенную хромосому человека, позволяет локализовать ген в этой хромосоме. Используя в блот-гибридизации ДНК гибридных клеток с транслокациями между хромосомами человека или между хромосомами человека и мыши, можно определить участок хромосомы человека, в котором локализован исследуемый ген (рис. VIII. 10).

Рис. VIII.9. Схема блот-гибридизации, по Саузерну

Особую роль в этом методе играют так называемые молекулярно-генетические маркеры (МГМ), например, фрагменты уникальных последовательностей ДНК (уМГМ), мобильные генетические элементы (мМГМ) и сгруппированные или кластеризованные ДНК-повторы (кМГМ), используемые для картирования хромосом наряду с обычными менделевскими маркерами, проявляющими свое действие на фенотипическом уровне. С их помощью можно не только локализовать ген, но и определить доминирование по наличию у гетерозигот определенного МГМ, например мМГМ. Предположим, что некий мМГМ имеет несколько вариантов распределения на политенных хромосомах дрозофилы (рис.

VIII. 11, а). Допустим, что у исходных особей дрозофилы, использованных в скрещивании, пара гомологичных хромосом различается по локализации мМГМ на препаратах политенных хромосом при гибридизации in situ с этим мМГМ: у мутантного самца А и С варианты, у самки - В и D варианты. У потомков от этого скрещивания возможны четыре варианта локализации мМГМ: А и В, А и D, С и В, С и D. Если мутантный фенотип будет проявляться у потомков, имеющих любой из гомологов исходного самца (А или С) и лишь определенный гомолог от исходной нормальной самки (например, В), то можно сказать, что у обоих родителей в генотипе есть мутантный аллель изучаемого гена. Самец - гомозиготный, а самка - гетерозиготная, и рецессивный аллель локализован в ее В-гомологе, т. е. речь идет о рецессивной мутации (рис. VIII. 11, б). Если мутантный фенотип обнаруживается только у потомков, имеющих, например, А-гомолог исходного самца, можно утверждать, что мутантный признак доминантный и соответствующий ему аллель локализован в А-гомологе, тогда как остальные гомологи исходных мух несут нормальный аллель (рис. VIII. И, в). Существенно отметить, что при обычном классическом анализе расщеплений в обоих случаях должно проявиться соотношение 1:1, что не позволит установить доминирования (для дрозофилы этот прием имеет только демонстрационное значение, так как определение доминирования на ней легко осуществляется в скрещиваниях). Важно, что такой анализ возможен и на других объектах, в частности на человеке, у которого обнаружен широкий полиморфизм МГМ. Вполне возможно, что с его помощью удастся выявить гены, контролирующие сложные (не моногенные) признаки, путем сопоставления локализации МГМ в однотипных семьях с каким-либо заболеванием.

Рис. VIII.10. Локализация гена в гибридной клетке (человекХмышь), содержащей транслокацию, с помощью блот-гибридизации. Гибридизуются фрагменты ДНК, соответствующие участку хромосомы 11, транслоцированному на хромосому 14. Ген инсулина человека локализован в теломерном районе 11-й хромосомы

Очевидное преимущество картирования хромосом с помощью МГМ, используемых в гибридизации in situ, состоит в том, что при этом можно картировать гены, не экспрессирующиеся в клетке, а также любые гены с неизвестной функцией. Наиболее эффективными МГМ служат последовательности, характеризующиеся умеренной копийностью (мМГМ) и нестабильной локализацией.

Рис. VIII.11. Схема локализации мМГМ на политенных хромосомах дрозофилы (а). Определение доминантности и рецессивности признака с помощью мМГМ (б, в)