X.2.2. Использование культур клеток млекопитающих в качестве тест-систем для выявления и количественного учета мутации

Для изучения действия различных мутагенов и учета генных мутаций в качестве тест-систем используют культуры клеток млекопитающих. Некоторые из них хорошо сохраняются в жидком азоте, что позволяет работать с большим числом клонов, имеющих одинаковые характеристики.

В качестве клеточных культур применяют клетки китайского хомячка (v 79 и СНО), клетки мышиной лимфомы (L 51784), фибробласты человека.

Линия v 79 маркирована биохимическими мутациями, в частности, по локусу ГФРТ, локализованному в Х-хромосом. Фермент ГФРТ (гипоксантин-фосфорибозилтрансфераза) катализирует превращение гипоксантина (ГК) и гуанина (Г). Нормальные клетки с активным ферментом ГФРТ в присутствии аналогов гуанина погибают, так как фермент ГФРТ превращает аналоги гуанина в токсичные для клеток соединения - мононуклеотиды, включающиеся в РНК и ДНК. Мутантные клетки в присутствии высоких концентраций аналогов гуанина выживают, так как фермент ГФРТ у них неактивен, а необходимый пурин они могут синтезировать de novo. Однако мутантные клетки погибают, если в них вводят ГК, аминоптерин, тимидин и глицин, в присутствии которых клетки неспособны использовать экзогенный пурин или синтезировать его de novo.

На этих свойствах основано выделение спонтанных и индуцированных мутаций, вызывающих устойчивость к аналогам гуанина. Поскольку такая устойчивость может быть следствием мутаций различных типов - замен оснований, "сдвига рамки считывания", нарушения структуры хромосом в областях структурных и регуляторных генов, - использование ГФРТ-локуса позволяет выявлять широкий круг мутагенов.

Клетки мышиной лимфомы применяют с 1972 г. для учета прямых мутаций в локусе тимидинкиназы (ТК). Для этого используют гетерозиготную по ТК линию клеток, способных расти на средах, подавляющих рост нормальных клеток.

Культура фибробластов кожи может быть получена практически от любого человека. Основным достоинством этой культуры является возможность сравнения чувствительности клеток, полученных от разных индивидуумов. Их недостаток - низкая эффективность вегетативного размножения, ограниченный срок жизни и плохая изученность мутаций в диплоидных клетках человека, а также наличие так называемой "метаболической кооперации", которая заключается в том, что мутантные клетки, лишенные активного фермента, могут получать его в результате контакта с клетками исходной популяции, при этом они становятся как бы фенотипически нормальными.

Для изучения чувствительности разных клеток организма применяют метод органных культур (клеток почки, легких, печени, селезенки и др.).