Невидимые почтальоны

Один из способов разгадать тайну - найти в ней уязвимое место. В науке это значит пытаться повлиять на неразгаданный процесс, научиться менять его то так, то этак и по полученным изменениям проникать в его смысл.

Примерно такая ситуация сложилась в лаборатории Ледерберга, когда его ученик Циндер предпринял попытку обнаружить половой процесс у салмонелл - бактерий, вызывающих кишечные заболевания людей и животных.

Циндер нашел два мутанта салмонелл, не растущих на минимальной среде. Один из них, названный LT22, не мог синтезировать три аминокислоты: фенилаланин, триптофан и тирозин, другой, LT2, не синтезировал метионина и гистидина.

После смешивания двух мутантов появились потомки, уже хорошо растущие на минимальной среде и способные к синтезу всех пяти аминокислот. Они были живыми свидетелями рекомбинации наследственного вещества двух мутантов. Циндер и Ледерберг решили, что это - следствие конъюгации. Оставалось проверить совсем немного - нужен ли прямой контакт для такого обмена? (Контакт между мутантами-родителями разумелся сам собой - в лаборатории давно уже работали с конъюгацией кишечных палочек. И все-таки Циндер и Ледерберг решили проверить.) Исследователи воспользовались несложным прибором - трубкой Дэвиса. Это обычная U-образная трубка, разделенная на две половины фильтром из пористого стекла, непроницаемого для бактерий. Трубку заполнили бульоном и поместили в одно колено - мутант LT22, в другое - LT2. Оба стали расти.

Чтобы омывать их одной и той же питательной средой, ее медленно пропускали из одного колена в другое.

Трубка Дэвиса

Итак, в U-образной трубке были те же условия, что в пробирке, где обычно смешивали обоих мутантов, не было лишь прямого контакта. Сказать по совести, ученые не ожидали увидеть рекомбинантов "дикого" типа.

Каково же было их изумление, когда в колене, где рос мутант LT22, обнаружились салмонеллы-рекомбинанты, способные самостоятельно синтезировать все пять аминокислот!

Так родилась задача со многими неизвестными. Было ясно, что в данном случае бактерии-гибриды - следствие не конъюгации, а какого-то еще неведомого у микробов процесса обмена наследственным веществом. Очевидно, агент, несущий информацию от одной бактерии к другой, проходит через пористые фильтры. Все остальное было загадкой. Тут-то ученые и стали наугад исследовать удивительный процесс.

Оказалось, что таинственный ФА (фильтрующий агент) - не химическое вещество. Он задерживается порами фильтров, пропускающих даже такие громоздкие молекулы, как белки и нуклеиновые кислоты, а при центрифугировании осаждается быстрее их. Значит, ФА - корпускула. А может быть, это... фаг?

Начались поиски умеренных фагов в мутантах. Но нашелся только один (его назвали Р22) и только в одном мутанте. Причем не в том, откуда "плыл" чудодейственный ФА, а в другом - к которому он "плыл" и который столь сказочным образом менялся под его влиянием. Словом, фаг Р22 нашли в мутанте LT22. Это было поразительно. Особенно потому, что десятки других Опытов подтвердили: найденный фаг и таинственный ФА - одно и то же.

Эта неувязка до чрезвычайности осложнила дело. Пока на помощь опять не пришла гипотеза. Ученые предположили, что за время опыта в трубке Дэвиса фаг Р22 совершает два рейса: туда и обратно. Освободившись каким-то таинственным образом от своей "квартиры" (мутанта LT22), он уходит в дальнее плавание, и струи среды несут его сквозь фильтр, к салмонеллам LT2. Они чувствительны к нему, там он размножается и... обогащается кусочками их хромосом, которые сам же разрушил. "Нагруженный" фаг плывет обратно, в колено, где растет мутант LT22, проникает в него и обогащает новыми наследственными признаками.

Оказалось, что мутант LT22 устойчив к этому фагу и служит его носителем, а значит, не может быть местом для жительства и размножения родственных фагов, тем более идентичных тому, кого он носит. Это, однако, не мешает ему адсорбировать и пропускать фаги в цитоплазму.

Позднее гипотеза обросла фактами и укрепилась. Так был открыт новый механизм генетического обмена у бактерий, получивший название трансдукции, что в переводе означает "проведение сквозь". Трансдукция помогла окончательно понять тайный смысл мирного "сосуществования" фага и бактерии, о котором мы уже знаем. Ведь если фаги переносят генетическую информацию из клетки в клетку, го эволюционные преимущества, приобретаемые бактерией от такого сожительства, с лихвой могут окупить вред, наносимый ей невидимым врагом.

Как только исследователи убедились, что передачу наследственных признаков осуществляет фаг, методика опытов чрезвычайно упростилась и U-образная трубка была отброшена. В ходе этих опытов выяснилось, что ноша одной частицы фага до смешного невелика: как правило, она передает один признак, реже - несколько, но и размеры хромосомы фага составляют примерно одну сотую часть хромосомы бактерии. Не может же в самом деле фаг тащить на себе груз, в 100 раз превышающий его собственный вес! Однако, вместе взятые, фаги передают разнообразнейшие признаки. Например, одни из них, пожившие внутри стрептомициноустойчивых бактерий, могут, заражая чувствительные к этому антибиотику бактерии, делать их устойчивыми. Другие сообщают микробам подвижность, помогая им обрастать жгутиками. Третьи переносят способность к спорообразованию, к выработке ядов...

С тех пор - а это случилось в 1952 году, - как Циндер и Ледерберг впервые с помощью фагов привили бактериям новой биохимический признак, тайна трансдукции завладела умами многих ученых. Сразу в нескольких лабораториях мира стали анализировать это удивительное явление. Прежде всего оказалось: клетка, куда проник фаг-переносчик, далеко не всегда делается его "квартирой". Он - почтальон и, выполнив роль посыльного, остается в цитоплазме клетки или погибает. И словно для того, чтобы еще дальше продолжить аналогию с почтальоном, фаги приносят разным клеткам разные известия.

Но вот вопрос: включается ли кусочек хромосомы бактерии в хромосому несущего фага или они находятся в его оболочке раздельно? Поначалу считали, что они существуют независимо друг от друга, что фаг - лишь пассивный переносчик. Но только - поначалу. Помните, фаг лямбда кишечной палочки К12? Так вот, он в корне изменил все представления о трансдукции. Этот фаг переносил всегда один-единственный ген, ответственный за синтез фермента, разлагающего сахар галактозу. Однако нагруженный новым геном фаг становился до странности не похож сам на себя. Он то "худел", то "поправлялся", но во всех случаях терял способность к воспроизведению потомков!

Строгие и точные опыты убедили ученых: фрагмент хромосомы бактерии рекомбинируется с хромосомой фага лямбда. При этом у него замещаются неравноценные по весу куски, отчего фаг-почтальон столь странным образом толстеет или теряет в весе (некоторые фаги могут недосчитаться целой трети своей хромосомы). Замена неравноценна еще и потому, что фаг утрачивает наиважнейшие гены и перестает размножаться.

Какие же напасти тогда подстерегают другие фаги, которые переносят не один-единственный ген, а практически почти любой из них? Чем они отличаются от фага лямбда? Экспериментаторы показали, что этот фаг всегда закрепляется на одном и том же месте хромосомы (около локуса Gal), а другие фаги - где попало. Вот почему они в разных опытах переносят разные участки хромосомы бактерии, обычно не отличаются от нормальных по весу, не теряют своей активности

и способности к размножению (или какой-либо иной). Однако они тоже обменивают кусочки своих хромосом на бактериальные, которые, видимо, не содержат важных для жизни фага генов, и потому фаги Р1, Р22 и их варианты почти не имеют дефектов.

И наконец, есть третья группа фагов, которые не обменивают часть своей хромосомы на бактериальную, а несут ее под оболочкой, как ношу. Таков фаг сенной палочки.

Фаги-почтальоны всегда получают свою ношу, разрушая клетку, независимо от того, была ли она ранее их квартирой или они внедрились в нее извне.

Самих почтальонов очень немного - примерно одна частица на миллион нормальных.

Каким способом объединяются принесенные фагом фрагменты с хромосомой новой бактерии-квартиры? Может ли фаг нести более одного признака? Эти вопросы еще требовали ответа. Особенно сожалели, что способ трансдукции неизвестен для кишечной палочки К12, у которой открыта конъюгация и составлены карты хромосомы. И вдруг трансдукция нашлась и у нее.

Возможности исследователей непостижимо расширились. Сразу же было сделано несколько открытий. Оказалось, что фаг может переносить от бактерии к бактерии почти любой ее ген и даже... другой фаг! Это установили Леннокс и Жакоб. В их опытах фаги Р1 и 363 "тащили" под белковой оболочкой не что иное, как часть хромосомы бактерии вместе с целой хромосомой (!) уже знакомого нам фага лямбда. Нелегкая, должно быть, ноша!

Фаги-почтальоны стали помощниками топографов хромосом, особенно когда выяснилось, что они могут передавать одновременно два и даже три тесно сцепленных на хромосоме бактерии гена и никогда не передают гены, отстоящие далеко друг от друга.

Но бывает и такое: неразлучные пары генов разлучаются, тогда потомки-трансдуктанты несут либо тот, либо другой из них. Как и при каких обстоятельствах это происходит? Ученые убедились, что "разлуку" приносит процесс рекомбинации, совершаемый в клетке, принявшей "ношу" фага. Но о судьбах хромосомных "пришельцев" надо говорить отдельно, сейчас важно лишь в общих чертах разобраться в процессах, совершаемых в клетке.

Исследователи предположили, что между хромосомой хозяина, и кусочком, принесенным фагом, происходит рекомбинация. Она подобна кроссинговеру хромосом клеток высших организмов. Так вот, чтобы из двух близкосцепленных генов в хромосому хозяина передался только один, необходимо, чтобы произошло два кроссинговера, причем один из них - между генами, контролирующими эти признаки (II).

Схема объединения принесенного фагом наследственного вещества с хромосомой хозяина

Понятно, что если в бактерию-гибрид попадут оба гена вместе, это значит: ни один из кроссинговеров не пришелся между ними. Шансы на то, что гены разделятся, повышаются с увеличением расстояния. Вот почему, сравнивая частоту совместной и изолированной передачи двух близлежащих генов, можно судить о расстоянии между ними.

До самого последнего времени считалось, что трансдукция существует только в мире невидимых. Советский исследователь С. М. Гершензон опроверг это положение. Он заметил, что вирусы ядерного полиэдроза, поражающие некоторых насекомых, способны подобно фагам заключать "перемирие" с клетками и жить в них, не причиняя вреда. И тут исследователь предположил, что эти вирусы тоже могут играть роль генных "почтальонов". Он размножил вирус ядерного полиэдроза на гусеницах тутового шелкопряда особой породы (черных, с темными яйцами). Потом этим вирусом заразил рыжих гусениц, которые всегда откладывали белые яйца. Оба эти признака (рыжая масть и белые яйца) были рецессивными.

Шло время. Зараженные вирусом рыжие гусеницы превращались в бабочек, откладывали яйца. И что же? Среди белых яиц ученый нашел несколько темноокрашенных. В контрольных опытах таких яиц не было, то есть мутаций не происходило. Значит... Значит ген темной окраски яиц рыжие гусеницы получили от вируса. Так впервые было показано, что вирусы могут переносить гены и между многоклеточными организмами.

Кажется, уже пора подвести некоторые итоги. Конъюгация и трансдукция, о которых было уже столько сказано, и трансформация, с которой еще только предстоит познакомиться, - все они по сути своей проявление полового процесса в невидимом мире. Открытие этого процесса у микробов позволило генетикам построить первые подробные карты хромосомы живого существа. О чем бы до сих пор ни шла речь, задача создания такой карты неизменно выходила на первый план. Она заставляла ученых искать новые объекты исследования, выдвигать гипотезы и тут же опровергать или подтверждать их, совершать открытия и снова терпеть поражение, потому что без этой карты они были подобны полководцам, которые ведут наступление на Природу с завязанными глазами.

Конечно, суть дела не в самой карте как таковой. Суть дела в том, какие именно гены на нее наносятся и что вкладывается в понятие "ген". Вспомним первые карты хромосомы плодовой мушки - дрозофилы. На них исследователям удалось найти место расположения генов, управляющих развитием глаз, крыльев, окраской тела, числом щетинок, полом особи. То же можно сказать о генах всех растений и животных, с которыми имела дело генетика.

Но что такое ген, определяющий, например, развитие глаза? Ученые с самого начала подозревали, что он не один, что это целое содружество, может быть, даже нескольких десятков генов, что их работа претворяется в мире молекул. Но как это доказать?

До того как генетики "обратились за помощью" к бактериям, строение и работа генов были объектом догадок и предположений, и только после картирования на хромосоме нейроспоры генов, управляющих синтезом триптофана и других аминокислот, были получены экспериментальные доказательства того, что гены управляют синтезом ферментов.

Глубокое изучение особых способов передачи наследственного вещества у бактерии позволило нанести на карту ее хромосомы гены, определяющие синтез большинства аминокислот, чувствительность или устойчивость к фагам и антибиотикам, сбраживание лактозы, галактозы, мальтозы, маннита, ксилозы и других сахаров; гены, контролирующие синтез некоторых витаминов, составных частей оболочки; гены вирусов, сосуществующих с клеткой, и многие другие. Мало того, некоторые области удалось подразделить на участки и проследить за несколькими последовательными этапами того или иного процесса.

От опыта к опыту "белых пятен" становилось все меньше. Все теснее выстраивались гены на карте хромосомы бактерии. Но ведь сама эта хромосома невелика. Ученым удалось вычислить ее размеры. И тут выяснилось, что гены физически уже лежат настолько близко, что счет расстояния между ними надо вести на... молекулы вещества. Генетики получили возможность перейти на язык химии. Как это себе представить?

Если вся дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) кишечной палочки размещена в ее хромосоме, то биохимики, приняв во внимание ее молекулярный вес и произведя необходимые расчеты, скажут вам, что одна хромосома бактерии владеет десятью миллионами (107) пар нуклеотидов...

Но... стоп! Мы умудрились на полном скаку врезаться в тонкую химию хромосомы, почти ничего не зная ни о нуклеотидах, ни о нуклеиновых кислотах. Так часто бывает в спешке. Кажется, все продумано до последней мелочи, чемоданы уложены, документы, билеты и деньги проверены, завтрак (на всякий случай) - в дорожной сумке. Словом, пора отправляться в путь, как вдруг обнаруживается, что с собой нет командировочного удостоверения. А без него и шагу не ступишь. Ничего не поделаешь, нам тоже надо "давать задний ход"...

...В 1869 году швейцарский биохимик Фридрих Мишер, работавший в Тюбингене, выделил из ядра клеток гноя вещество, которое он назвал "нуклеином". Вернувшись в Базель, ученый продолжил свои исследования, получая "сырье" из спермы лосося (тогда лососи еще поднимались во время нереста по Рейну до Базеля). Как только выяснилось, что "нуклеин" обладает кислотными свойствами, его стали называть нуклеиновой кислотой. С этого и началась ее история. Нуклеиновые кислоты оказались тесно связанными с ядрами клеток, вот почему они всегда интересовали генетиков.

В клетке высших организмов вся дезоксирибонуклеиновая кислота хранится в ядре, в его хромосомах. Вес ДНК в хромосомах для всех клеток данного вида постоянен, а в половых клетках ее всегда вдвое меньше. Кроме того, было замечено, что на наследственность клеток можно повлиять ультрафиолетовыми лучами, и наиболее действен в этом смысле участок, соответствующий спектру поглощения нуклеиновых кислот. Но все доказательства роли ДНК в наследственности были косвенными. Например, в клетках, кроме ДНК, находили белки (гистоны), содержание которых столь же постоянно. Кроме того, изменения наследственных свойств под влиянием радиации и спектра поглощения ультрафиолетовых лучей нуклеиновыми кислотами можно было объяснить и тем, что нуклеиновые кислоты - простые поглотители энергии. Они передают ее другим, еще не известным веществам, которые и изменяют наследственность. И хотя нуклеиновые кислоты "родились" в 1869 году, в науке до 1944 года господствовало мнение, что основным носителем наследственности является белок.

Экспериментально доказать истинную роль нуклеиновых кислот помогли опыты опять-таки на микробах.