ДНК "рождает" свою копию

Автопортреты-пристрастие многих художников. Не обошло оно и великого творца - Природу. В тайниках живой материи ежемгновенно совершается удивительнейший процесс - ДНК "рисует" свои автопортреты. Это единственный в своем роде случай, когда молекула удваивается, в точности копируя самое себя. К такому самовозрождению способны только молекулы наследственного вещества. Оно получило название репликации (от слова "реплика" - отпечаток).

Когда говорят о ДНК - говорят о репликации, когда говорят о хромосомах высших организмов - говорят об удвоении. Ведь хромосома - не чистая ДНК, и как синтезируются остальные ее элементы - неизвестно.

Знаменитая модель Уотсона и Крика, между прочим, оказалась привлекательной для исследователей еще и потому, что позволила легко представить себе способ репликации ДНК. Вначале важно было решить вопрос: разрывается ли лестница материнской ДНК при копировании или нет, а если разрывается, то каким образом - вдоль нити, превращаясь в две гребенки, или поперек, разделяясь на дольки? Так возникли три гипотезы. Первая представляла себе механизм воспроизведения ДНК консервативным (целость лестницы не нарушается), вторая - полуконсервативным (лестница разделяется вдоль на гребенки), третья - дисперсивным (ДНК рвется на фрагменты). Опыты подтвердили только вторую гипотезу. На ней мы и остановимся.

Как жаль, что в оболочку ядра живой клетки нельзя вставить кинокамеру и все увидеть своими глазами! Представьте себе, что клетке пришло время делиться. Быстро меняющиеся кадры показали бы нам, как спиральная лестница ДНК стала постепенно разворачиваться, вот уже рвутся водородные перемычки, соединяющие ее ступеньки: появляются две гребенки. Смотрите! К их тонким зубьям спешат нуклеотиды. Похоже, что какая-то невидимая сила притягивает их к молекуле ДНК. Впрочем, она есть - это сила притяжения, ранее объединявшая гребенки в лестницу. Нуклеотиды устремляются к половинке молекулы ДНК не как попало, а в строгом порядке: к аденину - тимин, к цитозину - гуанин, к тимину - аденин и т. д.

Интересно, до какой степени раскручиваются лестницы ДНК: так, что превращаются в две гребенки, или же этот процесс и синтез новой молекулы ДНК идет одновременно? Конечно, разрыв водородных связей не представляет особых трудностей - они гораздо слабее обычных молекулярных, но вот разделение полинуклеотидных цепей - дело непростое. Две цепи ДНК перевиты, как пряди волос в косе, и могут быть разделены только в результате многократных разрывов или раскручивания, подобно тому как раскручивается длинный электрический шнур, когда мы держим его за один конец и вращаем второй.

А между тем в клетке этот процесс совершается чрезвычайно быстро. Хромосома фага, например, содержит около десяти тысяч витков, а в бактериальной клетке она воспроизводится... каждые 2 минуты. Какая же должна быть скорость раскручивания, чтобы обеспечить этот процесс? Скорее всего старые цепи не раскручиваются полностью и синтез новых цепей идет с раскручиванием старых "рука об руку".

Вот уже и новые лестницы ДНК почти готовы. "Почти" - ибо ступеньки еще не прочны и удерживаются лишь слабыми водородными связями. Только когда ферменты "замкнут" связи между сахаром и фосфатом нуклеотидов, лестницы ДНК готовы, а в ядре вместо одной ДНК плавают две - дочерние, точные ее копии. Лестницы скручиваются в спирали, и процесс репликации ДНК закончен.

Но ведь это - только гипотеза. А как известно, в науке сотни гипотез родились и, не выдержав сурового натиска фактов, исчезли. Быть может, по сей день эта гипотеза колебалась бы между жизнью и смертью, если бы на помощь не "поспешили" микробы.

Но прежде чем рассказать об этих любопытнейших опытах, давайте разберемся в одном далеко не праздном вопросе. Что произойдет, если очень долго центрифугировать при скорости более 30 тысяч оборотов в минуту раствор какого-нибудь вещества? Специалисты ответят вам, что молекулы вещества при такой чудовищной скорости будут осаждаться, но этому все время будет мешать диффузия. Когда градиент установится, наибольшей окажется плотность слоя жидкости у дна пробирки. Ученые Мезельсон и Сталь заметили, что если в растворе несколько веществ, то возникает несколько слоев. Все молекулы, плотность которых одинакова, будут лежать в одном слое. Так возник аналитический метод для ДНК различной плотности.

Чувствительность этого остроумного метода оказалась удивительной: помещенные в хлористый цезий нормальная ДНК (ее плотность лежит в пределах плотности этого раствора) и ДНК, в которую включен тяжелый изотоп азота, располагаются в разных местах, давая две четко различимые полосы. Их можно увидеть, если сфотографировать пробирки после центрифугирования в ультрафиолетовых лучах. А ведь разница в весе этих ДНК ничтожная - каких-нибудь 0,8%. И тут исследователей посетила смелая мысль: разгадать загадку репликации ДНК. Для этого они решили пометить изотопом ДНК микробов-родителей и проследить за их судьбой в нескольких поколениях.

В прозрачный свежий бульон, в котором весь азот был заменен "тяжелым", засевали кишечную палочку. Уже через несколько поколений ДНК всех бактерий оказались мечеными, "тяжелыми", "легкий" азот исчез. Затем таких "отяжелевших" бактерий переселяли в бульон, где не было ни одного атома "тяжелого" азота. Бактерии продолжали жить и размножаться, но ДНК детей, внуков и правнуков "тяжелой" бактерии насыщались только "легким" азотом.

Как распределится между "детьми" материнское наследство - "тяжелый" азот? Всех ли поровну одарит материнская клетка или кому-то отдаст предпочтение? Это были очень деликатные опыты. Надо было извлекать из бульона каждое поколение микробов, чтобы не спутать их друг с другом.

Вот уже новое поколение - плод первого деления "тяжелых" клеток в обычной среде - получено. А вот его ДНК* Легче она или такая же, как у родителей? На этот вопрос ответила... ультрацентрифуга. Из каждого поколения микробов ученые выделили ДНК, поместили эти невидимые цепи в пробирки с хлористым цезием и, когда градиент плотности уравнялся, увидели три разные полосы.

Тяжелая ДНК микробов-родителей легла в своем особом месте. ДНК дочерних клеток первого поколения оказалась легче, ДНК дочерних клеток второго поколения - еще легче. Что же произошло?

Вот лесенка ДНК микробов-родителей. Она - самая тяжелая, потому что составлена из двух тяжелых гребенок (I). Вторая лесенка - ДНК дочерних клеток. Эти бактерии родились и выросли на среде с легким азотом. Их ДНК - гибрид. У нее одна цепь тяжелая, другая - легкая (II). Если гипотеза полуконсервативной репликации ДНК верна, то среди молекул ДНК внучатых бактерий можно найти нормальные и гибридные (III). Именно потому ДНК внучатых молекул в целом будет иметь несколько меньший вес и расположится в иной полосе плотности, чем ДНК дочерних молекул. Как мы уже знаем, ученые нашли в пробирках три слоя. Видимо, они принадлежали ДНК материнских, дочерних и внучатых микробов.

Модель репликации ДНК. I - исходная молекула; II - первая генерация (до-% черние молекулы); III - вторая генерация (молекулы-внуки)

Итак, данные опыта не противоречили гипотезе, но надо было добиться ее полного подтверждения. Вот если бы можно было разделить молекулы ДНК дочерних клеток на две нити и доказать, что они действительно состоят из разных гребенок - тяжелой и легкой...

Тайны природы подчас поражают своей простотой. В этом исследователи убедились еще раз, когда смогли, наконец, искусственно разъединить молекулу ДНК на две нити. Для этого потребовалось лишь прогреть ее до 100 градусов. За какую-то минуту она из лестницы превратилась в две гребенки... И тогда ученые разделили имеющиеся у них "меченые" ДНК трех видов на изолированные нити и все шесть опять поместили в хлористый цезий. Итоги опытов превзошли их ожидания: обе нити родительской ДНК оказались совершенно одинаковыми и лежали рядом в "тяжелой" полосе; дочерние и внучатые нити образовали "тяжелую" и нормальную полосы. Причем все дочерние молекулы ДНК и половина внучатых были гибридными, а вторая половина - нормальной, то есть свободной от "тяжелого" азота. И вот что любопытно: "тяжелую" нить ДНК ученые находили в десятках поколений кишечной палочки. Это был большой успех. Нить ДНК-родительницы проследовала из поколения в поколение, не потеряв ни одного атома!

Но и этого показалось мало: ведь у искателей страсть к познанию растет по мере ее удовлетворения. Осталось выяснить, можно ли осуществить и доказать полуконсервативный способ репликации ДНК в... пробирке? То есть в искусственных условиях, вне клетки. Эта мечта несколько лет жила в умах биохимиков, но стала обретать реальность лишь после того, как из кишечной палочки выделили особый фермент - ДНК-полимеразу. В клетках именно он направлял синтез ДНК. Этот фермент и превратил мечту биохимиков в реальность. Среди пионеров и создателей этого нового и увлекательнейшего направления молекулярной биологии надо назвать прежде всего исследователя Артура Корнберга и его сотрудников из Стенфордского университета.

Для успешного синтеза ДНК, кроме специального фермента, им потребовались ионы магния, все четыре нуклеотида и, что очень важно, - сама ДНК-затравка. Конечно, ученые не видели, как "рождалась" новая ДНК, но точные опыты показали, что она строилась в пробирке, причем новая нить содержала тот же порядок оснований, что и нить ДНК-затравки, которая, таким образом, играла роль шаблона. Синтез ДНК на затравке шел на обеих ее нитях и с обоих концов в противоположных направлениях.

Но вот что досадно: искусственно полученная ДНК не обладала биологической активностью. Значит, синтез ДНК в пробирке чем-то отличался от синтеза ДНК в клетке. И только в самые последние годы удалось пролить свет на это загадочное явление.

Рожденная в пробирке ДНК не была свернутой в спираль палочкой, а напоминала... ветвистое дерево. Между тем уже известно, что "работа" больших молекул зависит не только от того, из каких атомов они состоят, но в той же мере от их формы. Было очевидно, что в пробирке процесс синтеза ДНК протекает стихийно, а в живой клетке находится "на попечении" каких-то регулирующих веществ. Что они из себя представляют? Можно ли выделить их в чистом виде? Ученые поняли: чтобы ответить на эти вопросы, надо вернуться в клетку. Но как?

Французские исследователи Жакоб, Бреннер и Кузен предположили, что у хромосомы бактерии способность к репликации контролируют два гена. Один из них (его называют ген-инициатор) - невидимый рубильник, который включает в работу всю систему при помощи синтеза особого белка-активатора. Второй ген - это уже работающая деталь, это пункт отправления, место на хромосоме бактерии, с которого начинается репликация.

Но кто и каким образом включает рубильник? Иными словами: почему начинает работать ген-инициатор? Думают, что он запускает систему репликации хромосомы бактерии после того, как сам получит сигнал с поверхности бактериальной клетки. Оболочка клетки как бы сигнализирует: "Я созрела, и пришла пора рождать дочерние клетки - делиться". Чтобы удобнее было принять сигнал, нуклеоид бактерии должен каким-то местом своим крепиться к ее оболочке.

Сейчас эта гипотеза уже частично подтверждена. Ученые "подсмотрели" на ультратонких срезах бактерии сенной палочки, что иногда ее нуклеоид прикрепляется к цитоплазматической мембране (фото 16). Когда репликация начинается, отчетливо виден рост оболочки. И пока она не вырастет, нового сигнала для репликации не поступает.

Фото 16. Ультратонкий срез сенной палочки. Видно, что нуклеоид прикреплен к цитоплазматической мембране. Увеличение в 81 000 раз

В 1964 году Причард и Ларк нашли в бактериях два белка, каким-то образом связанных с репликацией ДНК. Один из них, видимо, включен в хромосому. Возможно, это белок клеточной стенки в месте, где прикреплена хромосома, а возможно, это и есть гипотетический инициатор?

И все же почему ДНК в пробирке напоминает ветви дерева, а в клетке она всегда подобна нити? Ключи к раскрытию этой тайны принесли исследования уже знакомого нам австралийца Кэйрнса.

И знаете, что натолкнуло его на это открытие? Изучение все того же штамма Hfr кишечной палочки. В 1963 году Кэйрнс наблюдал хромосому бактерии в период конъюгации и нашел, что она... удваивается. Но это было еще не все. Ученый, применив метод радиоаутографии, получил портрет ДНК (или хромосомы бактерии, что одно и то же) в тот момент, когда она рождала свою копию. Вы, конечно, помните, что хромосома бактерии-кольцо. Кэйрнс убедился, что она начинает строить дочерний обруч с одной точки (А), то есть "строительство" расширяется только в одном направлении. Новая нить все растет и растет, пока, наконец, не превращается в полное подобие своей родительницы (Б) и не отваливается от нее именно в той точке, где началось ее созидание.

Вот мы и вернулись с вами к штамму Hfr, в страну конъюгации. И вернулись не зря, потому что в последние годы хромосому штаммов Hfr стали использовать как модель для изучения репликации ДНК в живой клетке.

Схема репликации циркулярной хромосомы, по Кэйрнсу

В том же 1963 году Жакоб, Бреннер и Кузен показали, что конъюгация - это специализированный тип репликации ДНК и построили модель репликона. (Каждая хромосома бактерии представляет из себя единицу, способную к репликации, - репликон.) Главное его свойство - возможность реплицироваться как единое целое.

Видимо, внедрение полового фактора в хромосомы (помните, именно с этого начинается конъюгация бактерий) - это толчок к началу репликации. Может быть, половой фактор и есть та точка, с которой начинается строительство новой лестницы, ведь он тоже молекула ДНК. Правда, он гораздо меньше, чем молекула хромосомы бактерии, но может реплицироваться независимо от нее и даже быстрее и, что очень важно, может включать в себя несколько генов.

И поскольку половой фактор способен реплицироваться в клетке самостоятельно, то среди его генов вполне вероятны ген-инициатор и ген-репликатор. Видимо, эта ничтожная по размерам молекула ДНК играет исключительно важную роль в репликации хромосомы бактерии. Какую же?

Чтобы понять это, нам снова потребуется тот фантастический эксперимент, когда мы вставляли в стенку бактерии стекло и непосредственно наблюдали, как она превращается из обычного мужского штамма F⁺ в удивительный Hfr. Смотрите сюда, на внутреннюю стенку. Видите, здесь прямо к цитоплазматической мембране прикреплено крошечное кольцо. Да ведь это и есть молекула полового фактора! Странно, что она осела именно в том самом месте, где с обратной стороны, на поверхности клетки, чуть колышутся половые ворсинки. А может быть, это не случайность? Впрочем, не будем пока задавать вопросов.

Вот хромосома бактерии притянулась к половому фактору, как бы прилипла к нему. Теперь два невидимых кольца - большое и малое, хромосома и половой фактор, - слиплись своими ободками. Похоже, что хромосома начала делиться. Там, где к ней прильнуло кольцо полового фактора, появилось крошечное, еле заметное набухание, которое через несколько секунд стало похоже на пузыречек, а потом - на тоненькую ниточку. Кажется, кто-то все дальше и дальше оттягивает ее от хромосомы бактерии. Еще несколько мгновений, и рядом с родительским кольцом возникло новое, которое снялось со старого кольца-матрицы.

Почему же хромосома начала реплицироваться? Жакоб и его соавторы предполагают: в этом повинен ген-инициатор полового фактора. Он "включает" систему репликации хромосомы бактерии в тот момент, когда присоединяется к ней.

Схема переноса генетического материала при скрещивании HfrXF^-•FRep - это F-фактор, прикрепленный к бактериальной мембране

Эти исследования не оказались бесплодными для познания тонких механизмов процесса конъюгации бактерий. Прежде всего стало ясно, что из отцовской клетки в материнскую переносится вовсе не... отцовская хромосома, а новорожденный "двойник" хромосомы отца, ее копия. Стало ясно также, почему потеря куска или даже целой хромосомы нисколько не влияет на жизнеспособность бактерии-отца: потери-то попросту нет, старая хромосома целиком остается в клетке. Разрешился и вопрос о том, кто вытягивает (или толкает) хромосому бактерии-отца в материнскую клетку. Никто! Этот процесс идет за счет тех же источников энергии, которые обусловливают репликацию хромосомы, поскольку репликация ДНК и перенос новорожденной копии совершаются одновременно. И все-таки... в простой и изящной гипотезе еще много неточностей. Именно поэтому она все снова и снова подвергается проверкам и пересмотрам.

То, что в бактерию-мать переносится реплика хромосомы бактерии-отца, в настоящее время уже не служит предметом разногласий. Но вот что спорно: в какой момент переносится эта реплика? Жакоб и его сотрудники предполагают, что новая хромосома одновременно и строится и переносится в материнскую клетку. Но далеко не все с этим согласны.

- Новорожденная хромосома переносится только после того, как будет полностью достроена, - заявили американские ученые Адельберг и Боук. - Участок О, с которого начинается шествие хромосомы-реплики в бактерию-мать, оказывается свободным не в результате разрыва хромосомы, как это считали первооткрыватели конъюгации, а вследствие того, что после репликации хромосома не успела замкнуться в кольцо и короткое время "живет" в незамкнутом виде.

Так это или нет, покажет будущее. И очень может быть, что в то время, когда эта книга выйдет в свет, часть представлений о процессе репликации ДНК будет уже пересмотрена. Молекулярная биология развивается столь стремительно, что нередко книги устаревают по пути к своему читателю.

Итак, основа индивидуальности живой клетки и любого живого организма - это их наследственная информация, записанная на длинной ленте нуклеиновых кислот. Лента состоит из молекул четырех видов нуклеотидов, расположенных в определенной последовательности. (Возможное число их сочетаний уходит в бесконечность.) Эта последовательность целиком определяет потенциальную структуру, состав и даже поведение любого существа на земле, будь то бактериальная клетка или человек.

Но генетическая информация непрерывно искажается. Ее нарушают мутации. Как мы уже говорили, они могут возникать как следствие каких-то химических, физических или физико-химических воздействий. Именно из-за мутаций организм никогда в точности не воспроизводит самого себя. Мутационныи процесс - это вовсе не проявление какого-то несовершенства живой материи. Способность мутировать как раз и является одной из баз эволюции. Ведь искажение генетической информации немедленно приводит к появлению у такой особи, вернее, у потомков такой особи какого-то нового признака. И если этот признак вреден, то получивший его организм уничтожается естественным отбором. Но если признак полезен или изменившиеся условия сделали его полезным, то он закрепляется в потомстве и возникает организм с новым признаком. Таким образом, как выразился профессор Гарвардского университета Дж. Уолд, природа в процессе эволюции действует не как Великий Автор, а как Великий Редактор. Естественный отбор - это редактирование признаков, созданных случайными и непредвиденными мутациями.

По мере того как тайны строения и репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты приобретали реальные очертания, стал проясняться и загадочный химизм образования мутаций.