Фабрика жизни

Котлы высокого давления, большие температуры, десятки сложнейших агрегатов составляют "лицо" фабрики по производству полимеров. А живая клетка, невидимый сгусток жизни, справляется с задачей синтеза нужных ей полимеров - белков-куда проще и успешнее. Хотя эта ее "простота" пока еще совершенно недоступна химии.

Волшебная палочка, вызывающая чудо синтеза в клетке, - ее ферменты. Но как они работают? С какой стороны подступиться к решению загадки?

Прежде всего было самое простое предположение: синтез белка идет в ядре, на ДНК. Белок должен строиться там, где заложена его информация. Но очень скоро ученые убедились в том, что этот процесс совершается вовсе не в ядре, а... в цитоплазме.

В 1943 году Клодт обнаружил в цитоплазме клеток, помещенных под линзы электронного микроскопа, многочисленные гранулы. Потом оказалось, что они сидят на стенках бесчисленных канальцев и мембран цитоплазмы, как птицы на ветках.

Тайну гранул раскрыл в 1953 году американец Паладе. Он предположил, что именно в них клетка строит свои белки. Но как это доказать? В то время уже знали, что синтез белка не может проходить без участия рибонуклеиновых кислот. А если промыть клетку рибонуклеазой - ферментом, разрушающим эту кислоту? В результате такой процедуры гранулы исчезли, значит, они состояли из рибонуклеиновой кислоты. Обнаружили в них также и белки. И еще: меченные изотопами аминокислоты прежде всего появлялись в белках, находящихся на гранулах, а потом уже в цитоплазме. Значит, место синтеза белка должно быть именно здесь.

Гранулы назвали рибосомами. Теперь уже известно, что диаметр их равен примерно 150-200 ангстрем.

Стало ясно - синтез белка идет в цитоплазме, на рибосомах. Но кто же в таком случае передает им план построения белка с ДНК? Так появилась на свет гипотеза, которую считали классической, ибо она жила в науке 4-5 лет (а это при семимильных шагах биологии двадцатого века не так уж мало для гипотезы).

Каждый цистрон на ДНК - матрица для синтеза молекул РНК, в которых с точностью копируется информационный код цистрона. Новорожденная РНК направляется в цитоплазму и оседает на рибосомах. Там она в свою очередь служит стационарной матрицей для синтеза белка. Каждый цистрон имеет определенный тип рибосом, управляющий синтезом одного-единственного белка. Итак: один ген (цистрон) - одна рибосома - один белок.

Эта гипотеза победно шествовала по биологии, пока не споткнулась на одной "мелочи": молекулы рибосомной РНК во всех почти рибосомах клетки оказались "на одно лицо" как по размерам, так и по набору нуклеотидов.

Белки - разные, а рибосомная РНК - одинаковая! Как же построенная из одних и тех же нуклеотидов, по одному и тому же плану рибосомная РНК синтезирует столь отличающиеся друг от друга белки? Очень серьезная неувязка! И еще. Рибосомы бактерий, у которых уничтожена ДНК, перестают строить белки (а этого не случилось бы с автономными рибосомами). Почва под классической гипотезой стала колебаться.

Именно тогда французские ученые Жакоб и Моно заподозрили существование какого-то постоянно действующего химического посредника между ДНК ядра и РНК рибосом. Рибосомы клетки действительно похожи друг на друга. Вот почему Жакоб и Моно предположили, что сами рибосомы не могут строить белки. Это чудесное свойство им "прививает" особая РНК, рождающаяся на матрицах цистронов. ДНК каждого цистрона создает свою, неповторимую по составу РНК, в которой, как в зеркале, отражается код белка. Значит, в этой РНК любое основание комплементарно основанию в ДНК: против гуанина в ДНК - в РНК цитозин, против тимина - аденин, против аденина - урацил (в РНК он включен вместо тимина). Из всего этого следует, что такая РНК должна строиться в ядре клетки. Но ведь это были только предположения. Факты пришли позднее и не сразу.

В 1953 году Херши и Чейз обратили внимание на то, что после заражения фагом Т4 в теле кишечной палочки появляется небольшое количество новой РНК. Позднее ее исследовали американцы Волкин и Астрахан.

В то время никому, в том числе и самим исследователям, не могло прийти в голову, что эта РНК несет генетическую информацию, переписанную с ДНК-матрицы. Напротив, Волкин и Астрахан думали, что эта РНК - не что иное, как предшественница фаговой ДНК, так как по своему составу она приближалась к ней.

Говоря об этом, не следует забывать, что это были лишь первые шаги изучения ДНК. Всего лишь два года назад Уотсон и Крик предложили свою двуспиральную модель. И только несколько лет спустя, оглянувшись назад, наука поняла: Волкин и Астрахан впервые обнаружили РНК-копию ДНК-матрицы. Ее стали называть информационной РНК - сокращенно иРНК.

Позднее в теле бактерий обнаружили "обнявшиеся" друг с другом две цепи фаговых ДНК и иРНК. Выяснилось, что природа позаботилась даже об особой устойчивости таких гибридных цепей: они не разрушаются ни рибонуклеазой, ни дезоксирибонуклеазой. Советский ученый Хесин учел это качество гибридных спиралей для выделения иРНК фага из зараженной им клетки.

В 1961 году в пробирке был осуществлен... синтез РНК на матрице ДНК. Это сделали американец Очоа с сотрудниками. Для опыта они взяли фермент РНК-полимеразу. В присутствии ДНК-затравки и четырех оснований он строил РНК с той же последовательностью нуклеотидов, как и в ДНК. Экспериментаторы сделали вывод, что именно этот фермент в живой клетке собирает информационную РНК. Ее молекулы из ядра текут на рибосому, где вместе с рибосомной РНК строят нужный белок, чертеж которого она принесла с собой. Следовательно, рибосома - это мастерская белкового синтеза, а иРНК - чертеж, по которому она работает.

Еще Жакоб и Моно предположили: жизнь иРНК недолговечна. И это подтвердили опыты. Недавно стало известно, что иРНК сенной палочки живет не более 2 минут. Ее жизнь коротка, но работоспособность колоссальна! За 2 минуты одна молекула строит... до 20 одинаковых молекул белка!

Однако окончательно утвердилась гипотеза биосинтеза белка Жакоба и Моно после опытов с кишечной палочкой, пораженной фагом Т4. Микробов вырастили на особой питательной среде: вместо обычных атомов азота и углерода им предложили их тяжелые изотопы C¹⁴ и N¹⁵. В итоге все тело бактерий насыщалось только тяжелыми атомами, которые входили в состав белков, углеводов, нуклеиновых кислот... Рибосомы, естественно, тоже становились "тяжелыми".

На "поднявшихся в весе" бактерий пускали фаг Т4 и, подождав 5-10 минут, пока он проникнет внутрь, всех вместе переселяли в среду с обычными, "легкими" изотопами. После этого и фаговая РНК, и фаговая ДНК, и белки фага оказывались "легкими".

Как известно, в бактериях, пораженных фагами, синтезируются только фаговые белки и ДНК. Отделить легкие фракции от тяжелых было нетрудно при центрифугировании в градиенте плотности концентрированного раствора хлористого цезия. И вот что выяснилось: новая фаговая РНК связалась с рибосомами, но сами рибосомы не изменились: они по-прежнему были "тяжелыми". Ни одной "легкой"!

Тогда какие же рибосомы синтезировали фаговый белок? Очевидно, старые, бактериальные. Но ведь фаговый белок не похож на белок бактерии? Вывод мог быть только один - старые рибосомы строили фаговый белок, получая новую информацию от фаговой ДНК. А ее могла передать им только фаговая иРНК. И действительно, с помощью атомной метки ее нашли на микробных рибосомах. Так была развенчана "классическая" гипотеза.

Процесс считывания информации с ДНК на иРНК был назван транскрипцией, а передача информации с иРНК на полипептид (биосинтез белка) - трансляцией.

Лабиринт загадок уводил ученых все дальше и дальше. С какой из двух цепей ДНК, например, считывает иРНК информацию?

- С обеих! - ответили опыты по синтезу РНК в пробирке.

Они проводились с большой тщательностью, и все-таки ученые сомневались: ведь уже было известно, что синтез в пробирке далеко не то, что в живой клетке.

В 1960 году в лаборатории американца Мармура сделали важное открытие: исследователи научились соединять разорванные нити ДНК в двунитчатую структуру. Теперь стало возможным получать гибридные цепи ДНК, объединять цепь ДНК и РНК и т. д. Через три года этот метод помог экспериментаторам доказать, что в живой клетке иРНК снимает информацию только с одной нити ДНК. Вот как это было.

У сенной палочки есть бактериофаг, нити ДНК которого легко различить: в одной резко преобладают пиримидины, в другой - пурины. Нить пиримидиновая значительно легче, чем пуриновая, и они отделяются после длительного центрифугирования в хлористом цезии. Вот эта-то уникальная ДНК фага сенной палочки и послужила ключиком к раскрытию загадки транскрипции.

В зараженной фагом бактерии появляется фаговая иРНК. Она передает информацию с ДНК на рибосомы бактерии, которые строят фаговый белок. Теперь представим себе, что информация считывается с обеих нитей ДНК. Тогда в клетке возникнет фаговая иРНК двух сортов - легкая и тяжелая. А если код ДНК читается только с одной нити? Тогда и иРНК должна быть только одна - либо легкая, либо тяжелая.

Бактерии заразили чудесным фагом и выделили из них иРНК. Это могла быть и фаговая, и бактериальная иРНК. Как же отличить их друг от друга? Попытаться соединить с обеими разрозненными нитями фаговой ДНК. Фаговая иРНК комплементарна фаговой ДНК и обязательно соединится с ее нитями...

С нитями или с нитью?

Надо ли говорить, что в ответе на этот вопрос заключалась вся суть опыта. Фаговая иРНК объединилась в гибридный комплекс только с легкой нитью ДНК, содержащей большое количество пиримидинов. Значит, в живой клетке транскрибируется только одна, "осмысленная" нить. Другая "бессмысленна" и нужна лишь для репликации.

И вот что удивительно: в пробирке с той же ДНК фага иРНК синтезировалась "на обеих нитях"! Какой механизм регулирует "осмысленность" транскрипции в клетке? Этого еще никто не знает.

Транскрипция заканчивается "рождением" иРНК, которая направляется на рибосому, где служит матрицей для синтеза белка. Так наступает фаза трансляции, фаза передачи информации с иРНК на белок. Вспомним, что последовательность оснований в иРНК кодирует последовательность аминокислот в белке. Они должны располагаться в соответствии с расположением кодонов на иРНК, то есть попадать только в свое место. Но кто "подвозит" и ставит на место нужные аминокислоты? Этим не могут заниматься ни иРНК (она не "отлучается" с рибосомы, пока белок не будет собран), ни уж, конечно, рибосомальная РНК (она накрепко "пришита" к месту). Так родилась гипотеза о молекулах-перевозчицах.

Примерно в то время, когда идеи эти еще только зарождались у Крика и его сотрудников, ученый Хогленд открыл в цитоплазме клеток печени крыс особую РНК, которую стали называть растворимой, или транспортной (сокращенно тРНК). Среди своих сестер она была легчайшей по молекулярному весу (27-28 тысяч), ее молекулы содержали всего по 70-90 нуклеотидов.

Исследования установили, что каждая аминокислота связывалась только со специальной тРНК. Они отличались многоликостью по набору нуклеотидов: одна, другая, третья...

Модель молекулы транспортной РНК

- Видимо, молекул-перевозчиц столько же, сколько седоков-аминокислот, - предположили биохимики. Это оказалось верным. Вскоре число известных тРНК подошло к 20. Но какова конструкция "экипажа"?

Рентгеноструктурный и химический анализы помогли создать портрет тРНК. В 1962 году ученый Спенсер изобразил ее в виде простой модели. тРНК - это полинуклеотидная цепь. Она похожа на согнутую пополам и потом закрученную винтом шпильку. Половинки - ряды комплементарных оснований - соединялись друг с другом, как в ДНК, водородными связями. Конец одной половинки оставался свободным.

Как узнают молекулы транспортной РНК место на рибосоме? Видимо, у них на станции назначения есть свой "пароль". Какой он? Один для аминокислот мы уже знаем - это код, записанный на ДНК и переписанный на иРНК. Вряд ли природа стала бы выдумывать что-то новое для молекул-перевозчиц. Очевидно, они подчиняются тому же нуклеотидному триплетному коду. Только, разумеется, комплементарному для иРНК. Например, если на ДНК код ЦЦГ, то на иРНК он будет ГГЦ, на тРНК-ЦЦГ.

Опыты подтвердили эту гипотезу. Ведь если в обоих "плечах" шпильки основания комплементарны, то аденина должно быть столько же, сколько урацила, а цитозина - столько же, сколько гуанина. Это было почти так. Но с этого "почти" все и началось. Химики обнаружили в тРНК неспаренные основания, так называемые минорные. Среди них и нашли новый "пароль".

Это были неспаренные нуклеотиды, комплементарные кодовым нуклеотидам на иРНК. Стало очевидно: молекулы- перевозчицы, доставив аминокислоту к РНК-матрице, где идет синтез белка, прикрепляются к ней комплементарным триплетом в том гнезде, где комплементарным триплетом иРНК закодирована именно эта аминокислота. И так, выстраивая одну аминокислоту за другой, иРНК строит белковую цепь. Как только аминокислоты соединяются друг с другом пептидной связью, тРНК пускается в обратный путь, за новым "пассажиром".

Факты укрепляли эту гипотезу со всех сторон. Но вот одно маленькое упущение, грозящее обрушить целый угол в стройном здании гипотезы. Если тРНК использует код-пароль для "узнавания" квартиры своего пассажира на иРНК, то как, вернее, чем она "узнает" аминокислоту?

Сами создатели гипотезы задумывались над этим. И знаете, в чем тут секрет? Ведь свободный конец транспортной РНК, где, как выяснилось, присоединяется нужная аминокислота, у всех 20 молекул-перевозчиц... одинаков. Он построен из трех нуклеотидов: два цитозина и аденин (ЦЦА). Как же молекулы-перевозчицы узнают того единственного пассажира, которого они перевозят? Очевидно, не обходится без помощников.

Справедливо решив, что в природе самые опытные следопыты по молекулам-ферменты, ученые возложили "узнавание" аминокислот на них. Тем более, что первые сообщения об особых ферментах-активаторах аминокислот - уже появлялись на страницах журналов. Вскоре стало очевидно, что таких ферментов двадцать, ровно столько же, сколько аминокислот. Именно они находят нужную аминокислоту, самое главное - каждый фермент "усаживает" "свою" аминокислоту на ее "персональную" тРНК.

Итак, место на строящейся полипептидной цепи узнается не самой аминокислотой, а транспортной РНК, которая "везет" аминокислоту на рибосому. Аминокислота "глуха" к коду иРНК, а иРНК "слепа" к аминокислоте. Как об этом узнали? Оказалось, что молекулу тРНК можно "обмануть". Такую шутку сыграли с ней американские ученые Липпман, Шепевил и другие. Они выделили в чистом виде комплекс цистеиновой тРНК со своей аминокислотой (цистеином) - "перевозчика с пассажиром". А затем, отцепив от цистеина группу молекул (SH), подменили "седока". Цистеин, "не вылезая из экипажа", превратился в другую аминокислоту - аланин. При этом тРНК "не заметила" подмены и благополучно доставила аланин на рибонуклеиновую матрицу, в то место, где должен был включаться цистеин. Вы думаете, иРНК заподозрила ошибку? Нет! Она узнала только тРНК и допустила неправильную аминокислоту в белок.

Итак, РНК-матрица "узнает" только тРНК, а не несомую ею аминокислоту. Перенос аминокислоты с тРНК на иРНК активируется специальными ферментами переноса.

А теперь посмотрим на рисунок. Так Маршалл Ниренберг в 1963 году нарисовал процесс транскрипции и трансляции. Справа - цистрон двунитчатой ДНК, с которой иРНК считывает код для белка. Вот иРНК осела на рибосомы. Транспортные РНК подвозят нужные аминокислоты (обозначены цифрами), которые притягиваются на иРНК ферментами переноса. Пептидные связи между аминокислотами замыкаются, а тРНК уходят за новыми. Так строится белок.

Важно отметить, что информация, видимо, всегда считывается с определенной начальной точки. На ДНК ее считывает иРНК, на рибосомах последовательность оснований с иРНК считывается тРНК. Синтез белка - тоже поляризованный процесс: он начинается на определенном конце полипептидной цепи и идет к другому ее концу.

Поначалу думали, что белок строит одна рибосома. Но в электронном микроскопе эти микроверфи оказались размером в каких-то 230 ангстрем, а длина одной иРНК - до 20 000 ангстрем. Нечего и думать о том, чтобы разместить ее на одной рибосоме, даже если бы пришлось обвить ее как нить вокруг шара. И теперь считают, что фабрика белка - это объединения рибосом, полисомы.

Белок собирается на конвейере из нескольких рибосом, которые катятся вдоль нити иРНК и, когда полипептид (белковый блок) построен, а ненужная иРНК разрушается, рибосома свободно падает с нее в цитоплазму. В 1962 году такие полисомы увидели в электронный микроскоп. При увеличении в 400 000 раз они предстали перед учеными подобно обрывкам разорванных бус.

Схема построения белка, по Ниренбергу, Цифры - различные аминокислоты

Итак, белки рождаются в клетках под контролем нуклеиновых кислот. Только их молекулы могут построить первичную цепь полипептидов. Но ведь белок, не свернутый в третичную структуру, - это мертвый белок. Кто вдохнет в него жизнь? Этого не знали.

Когда десять лет тому назад Френкель-Конрат начинал свои опыты по реконструкции вируса табачной мозаики, он и не предполагал, к каким поразительным выводам они приведут.

Но не будем забегать вперед.

Вирус мозаичной болезни табака ВТМ - это микроскопическая изящная палочка, состоящая из нуклеинового стержня, завернутого в белковую оболочку. Самый стержень - одна длинная молекула РНК весом в 2•10⁷, а белковый чехол - ткань из 2•130 молекул белка.

РНК и белок можно отделить друг от друга. Мало того, белок можно растворить в щелочи, разбить на молекулы или небольшие агрегаты молекул.

Если осколки некогда стройного белкового футляра поместить в мешок - полупроницаемую мембрану и опустить его в воду, щелочь уйдет из раствора. И тогда обломки белка... воссоединяются. Они собираются точно так, как стояли до разрушения. Но ведь в мембранном мешочке никого не было. Значит, молекулы белка "помнят" свое прежнее место" структура чехла заложена в них самих. И чтобы в клетке образовалась четвертичная структура белка, клетке не нужно ничего, кроме самого белка в определенной концентрации. Когда его соберется достаточно - это служит сигналом к сборке четвертичной структуры.

А теперь вернемся еще раз к загадке кода.

Повествуя об этапах биосинтеза белка в живой клетке, мы приводили примеры кодонов на ДНК и РНК. Но все они были произвольные. А что можно сказать о конкретных кодонах для каждой аминокислоты?

До 1961 года они оставались для биологии тайной. Но в 1961 году...