1.4. ДНК эукариот содержит повторяющиеся последовательности [1989 Георгиев Г.П.

Открытие повторяющихся последовательностей [27]. Примерно в те же годы начались исследования, позволившие установить другое фундаментальное отличие организации генома у высших организмов, а именно существование в нем многочисленных повторяющихся последовательностей. Эти работы были выполнены группой Р. Браттена (США). Авторы изучали процессы ренатурации и гибридизации нуклеиновых кислот.

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение рН и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль,- происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходить образование гибридов ДНК-РНК - гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы.

Ренатурация нуклеиновых кислот идет в два этапа. На первом в результате случайных столкновений одно-цепочечных молекул происходит правильное соединение двух коротких комплементарных отрезков, а затем, как у молнии, идет быстрое "схлопывание" по всей длине с образованием полной двухцепочечной молекулы. Обычно скорость реакции лимитирует ее первая стадия, или стадия нуклеации. Естественно, что чем выше концентрация ДНК и чем она однороднее, тем чаще будут сталкиваться комплементарные цепи и тем быстрее будет идти реакция. Если весь геном организма уникален и в нем нет одинаковых участков, то скорость ренатурации при прочих равных условиях будет находиться в обратной зависимости от размеров генома. Для безъядерных организмов (прокариот), как показали Бриттен и сотр., это действительно так. Логарифм произведения исходной концентрации ДНК (С₀) на время, необходимое для полуренатурации ДНК ч (t¹/₂), прямо пропорционален размеру генома.

Однако у ядерных организмов, эукариот, как показали те же авторы, это правило нарушается. Содержание ДНК на клетку у этих организмов, размер их генома в десятки и сотни раз больше, чем у бактерий. Однако значительная часть всей ДНК, от 15 до 70 %, ренатурирует гораздо быстрее, чем остальная часть ДНК, со скоростью большей или равной таковой у бактерий. Был сделан вывод, что некоторые отрезки ДНК у эукариот многократно повторяются в геноме.

Три класса последовательностей в геноме [27]. Дальнейшие исследования позволили разделить геном на три класса последовательностей:

Сателлитная ДНК представлена в геноме простыми последовательностями длиной от нескольких до нескольких сот нуклеотидов, повторенными сотни тысяч, а иногда и миллионы раз и сблокированными вместе, т. е. образующими в хромосомах однородные участки. Так, у Drosophila virilis повторяются 7-нуклеотидные сегменты АСАААСТ, АТАААСТ или АСАААТТ, образующие три разных сателлита. Сателлитная ДНК обычно концентрируется в так называемых центромерах и теломерах. Центромеры - это участки, по которым митотические хромосомы прикрепляются к нитям веретена. Теломеры - это концевые участки хромосом. И те и другие, очевидно, не несут генетической информации, но играют структурную роль в организации хромосом и их правильном разделении при митозе. В этих процессах, вероятно, и участвуют простые последовательности сателлитной ДНК.

Умеренно повторяющиеся последовательности составляют от 10 до 50 % всего генетического аппарата у разных видов эукариот. Они рассеяны по геному, образуя отрезки длиной от нескольких сот до нескольких тысяч нуклеотидов. Сильно варьирует и степень их повторяемости. Одни семейства состоят из нескольких десятков, тогда как другие - из сотен тысяч членов. В отличие от сателлитной ДНК, которая инертна, умеренные повторы активно транскрибируются в клетке, т. е. на их матрице идет активный синтез РНК.

Остальная часть генома представлена уникальными последовательностями, т. е. отрезками ДНК, встречающимися в геноме один или небольшое число раз. Скорость ренатурации таких ДНК ниже и соответствует размерам генома.

Три класса ДНК хорошо выявляются на кривых ее ренатурации (рис.3), если откладывать на оси абсцисс логарифмы C₀t, т. е. произведения концентрации ДНК (моль Р/л) на время (с), а по оси ординат - процент ренатурированной ДНК. Например, у млекопитающих около 15 % ДНК ренатурирует в интервале C₀t от 10^-5 до 10^-3 (сателлитная ДНК), еще 10-20 % - в интервале C₀t от 10^-2 до 10¹ (умеренные повторы) и остальные ~70 % (уникальная ДНК) - в интервале от 10² до 10⁴.

Существование большого числа повторяющихся нуклеотидных последовательностей в геноме - это вторая универсальная черта в организации генетического аппарата эукариотических организмов, отличающая их от бактерий и вирусов.

Два типа организации умеренных повторов в геноме [28, 29]. В дальнейшем Р. Бриттен и присоединившийся к нему Э. Дэвидсон более подробно изучили свойства умеренных повторов в геноме. Было выявлено два основных класса таких повторов: короткие, длиной в 100-300 пар нуклеотидов (п. н.), и длинные - несколько тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.). У большинства видов, например у многих земноводных и млекопитающих, преобладают короткие повторы, перемежающиеся с отрезками уникальной ДНК длиной около 1 т. п. н., тогда как у некоторых других (например, у D. melanogaster) короткие повторы не выявлялись, а вместо них умеренно повторяющаяся ДНК входила в состав длинных отрезков генома (несколько т. п. н.), перемежаясь с участками уникальной ДНК длиной несколько десятков т. п. н. Авторы развили представление о двух основных типах организации генома: подобному геному Xenopus (в основном короткие повторы) и подобному геному дрозофилы (длинные повторы).

Рис. 3. Кривые ренатурации ДНК мыши и ДНК из Е. coli Фрагменты денатурированной ДНК размером 400 п. н. отжигали при разных величинах C><sub>0</sub>t и определяли количество ренатурированной ДНК с помощью хроматографии на гидроксилапатите. ДНК Е. coli денатурирует в узком интервале C<sub>0</sub>t, будучи представлена только уникальными последовательностями, ДНК мыши распадается на несколько кинетических компонентов (по результатам, полученным Дж. Хирстом)

Рис. 3. Кривые ренатурации ДНК мыши и ДНК из Е. coli Фрагменты денатурированной ДНК размером 400 п. н. отжигали при разных величинах C₀t и определяли количество ренатурированной ДНК с помощью хроматографии на гидроксилапатите. ДНК Е. coli денатурирует в узком интервале C₀t, будучи представлена только уникальными последовательностями, ДНК мыши распадается на несколько кинетических компонентов (по результатам, полученным Дж. Хирстом)

Природа как коротких, так и длинных повторов была загадочной. Лишь небольшая часть их приходилась на повторяющиеся гены, например гены для рРНК или для гистонов. Большинство же их как будто не несло никакой генетической информации. Этот парадокс организации эукариотического генома также не был решен до внедрения методов генной инженерии.