1.3.1* Характеристика ядерной дРНК (гетерогенной ядерной РНК): дРНК как предшественник мРНК цитоплазмы

Характеристика полученных фракций ядерной РНК началась с определения их размеров методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Раствор РНК наслаивается в центрифужную пробирку на столбик буфера с возрастающей концентрацией сахарозы и ультрацентрифугируется. Пробирка протыкается снизу, и собираются фракции, в которых определяют РНК. Градиент сахарозы не дает слоям перемешиваться. Определив место РНК в пробирке после центрифугирования и пройденный ею путь, можно рассчитать ее размеры.

Оказалось, что дРНК характеризуется сильной гетерогенностью, т. е. входящие в ее состав молекулы сильно различаются по своим размерам: седиментационные коэффициенты варьируют от 12S до 50-70S (рис. 2).

Рис. 2. Свойства ядерной ДНК-подобной РНК (дРНК, гяРНК, про-мРНК) а - ультрацентрифугирование в сахарозном градиенте (16000 об/мин, 12 ч) ядерной дРНК печени крысы, полученной методом фенольного термического фракционирования. Клетки метили [³²Р] - ортофосфатом in vivo в течение 2,5 ч. Удельная активность тяжелых фракций выше, чем легких. 1 - радиоактивность, 2 - оптическая плотность; б - сравнение молекулярных масс ядерной дРНК и мРНК цитоплазмы из печени крысы. Клетки метили [³²Р] - ортофосфатом в течение 6 ч в присутствии малых доз актиномицина D, подавляющих синтез рРНК. Далее ядерную дРНК и РНК цитоплазмы ультрацентрифугировали в сахарозном градиенте. Видно, что размеры ядерной дРНК (1) намного превышают размеры цитоплазматической мРНК (2); в-е - электрофоретическое разделение фракций РНК из клеток асцитного рака Эрлиха, меченных в течение 30 мин [³²Р] - ортофосфатом. Фракции получали термическим фенольным фракционированием при 40 (в), 55 (г), 63 (д) и 85° (e). 1 - УФ-поглощение, 2 - радиоактивность. Во фракциях 40 и 55° видны радиоактивные пики предшественников рРНК (45S, 32S и др.), новообразованная ядерная дРНК (фракции 63 и 85°) гетерогенна и имеет очень высокую молекулярную массу; ж - гибридизация меченой мРНК полисом печени крысы с ДНК в присутствии конкурента - немеченой ядерной дРНК. Видно полное подавление связывания мРНК при добавлении ядерной дРНК; з - гибридизация тяжелой ядерной дРНК с ДНК в присутствии конкурента: полисомной РНК (1) или тотальной РНК (2). Тотальная РНК полностью подавляет связывание дРНК, а полисомная РНК (мРНК) менее чем на 30 % (по результатам, полученным О. П. Самариной, В. Я. Арионом, Г. Марковым и др.)

В этих опытах определяли также размеры и состав новообразованной РНК, т. е. РНК, которая синтезировалась за тот период времени, в течение которого клетки инкубировали с меченым предшественником РНК, например с [³²Р] - ортофосфатом. Если за тотальной РНК можно следить по распределению материала, поглощающего ультрафиолет при длине волны 260 нм, то новообразованную РНК можно выявлять по радиоактивности.

Поскольку синтез РНК идет в ядре, ядерная РНК после короткой инкубации клеток с радиоактивным предшественником метится намного сильнее, чем РНК цитоплазмы. Нуклеотидный состав новообразованной РНК, определяемый по распределению [³²Р] между нуклеотидами, в наших фракциях ядерной РНК был таким же, как и нуклеотидный состав общих РНК фракций. Однако по размерам новообразованная ядерная РНК превосходила общую ядерную РНК.

В случае дРНК она также была весьма гетерогенной по размерам, но при этом сдвинута в тяжелую сторону (см. рис. 2). Если инкубацию клеток с меченым предшественником вели долго (несколько часов), размеры новообразованной и тотальной РНК совпадали. Можно было предположить, что в ядрах очень длинные цепи новообразованной дРНК подвергаются далее расщеплению и укорачиваются.

При исследовании дРНК перед нами сразу возник вопрос, в какой связи ядерная дРНК находится с мРНК в цитоплазме, которая к тому моменту еще не была изолирована. Было, однако, очевидно, что последняя тоже должна отличаться по своему составу от рРНК и быть связанной с рибосомами, т. е. транслироваться. Чтобы выявить ее, мы ввели в практику метод "актиномицинового полублока". Клетки обрабатывали актиномицином D, антибиотиком, который, как было показано другими авторами, блокирует синтез РНК и особенно эффективно синтез рРНК. Использовались малые дозы актиномицина, подавлявшие синтез рРНК, но не влиявшие на синтез дРНК. В результате практически вся новообразованная РНК клетки представляла собою дРНК. Таким образом, можно было легко выявить дРНК в цитоплазме и определить ее размеры. Оказалось, что по размерам новообразования ядерная дРНК примерно в 5 раз превышает цитоплазматическую дРНК (см. рис. 2). На основе этих результатов была сформулирована гипотеза, согласно которой ядерная дРНК является высокомолекулярным предшественником мРНК, или про-мРНК- В ходе созревания про-мРНК в мРНК она расщепляется на более короткие цепи. Существование такого предшественника отличает клетки высших организмов от клеток бактерий. Эта концепция была впервые сформулирована в работе О. П. Самариной.

В 1964-1965 гг. начались и активные исследования ядерной дРНК в других лабораториях. Почти одновременно 4 группы в Японии, Франции и США, а также К. Г. Газарян (Институт молекулярной генетики АН СССР) вновь описали эту РНК (правда, не выделив ее в чистом виде, как было сделано у нас). Как это обычно принято у американцев, ей было присвоено новое имя - "гетерогенная ядерная РНК" (hnRNA, гяРНК). Существенным вкладом этих групп явилось доказательство того, что большая часть ядерной дРНК распадается, не покидая ядра.

Концепция о гигантской ядерной РНК как предшественнике мРНК цитоплазмы прошла длинный путь постепенного накопления доказательств, пока не получила полного подтверждения уже в эру генной инженерии. Как бы то ни было, само существование такой РНК, вопрос о том, почему вначале образуется гигантский предшественник, были непонятны и составляли один из парадоксов организации генома эукариот.