Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

2.2. Организация 5'- и 3'-концов в первичном транскрипте и мРНК

Поли (А) [61, 62]. После того как были развиты гипотезы о структуре единиц транскрипции (см. разд. 1.5), возник вопрос о возможных путях их проверки. Поскольку в тот момент генноинженерные подходы еще не были доступны, единственным возможным путем было изучение строения про-мРНК и мРНК и их сравнение между собою. Прежде всего надо было промаркировать их концы - 5' и 3'.

Такая работа была начата в ряде лабораторий. Первый важный результат был получен М. Эдмондс и Дж. Браверманом (США), которые обнаружили, что на 3'-конце почти всех мРНК и примерно половины молекул про-мРНК находится отрезок поли (А) длиной от 50 до 200 нуклеотидов. Такие отрезки поли (А) не были найдены в геноме. Отсюда вытекало, что они присоединяются посттранскрипционно, т. е. к З'-концу уже синтезированной на матрице ДНК про-мРНК. Действительно, дальнейшие эксперименты показали, что только что синтезированная про-мРНК лишена поли(А), но вскоре происходит его ферментативное нематричное присоединение. Процесс полиаденилирования про-мРНК происходит в ядре. В цитоплазме поли (А) обычно укорачивается и поэтому средний размер поли (А) в про-мРНК выше, чем в мРНК. Поли (А) служит надежным маркером 3'-конца в мРНК и про-мРНК. Более того, за поли (А) можно выловить мРНК из смеси с другими РНК цитоплазмы путем хроматографии на поли(и)сефа-розе или олиго(аТ) целлюлозе. Поли (А) при этом образует гибриды, и мРНК задерживается на колонке, откуда ее элюируют, понижая ионную силу раствора и повышая его температуру. Таким образом удается получить мРНК с высокой степенью чистоты. Следует при этом отметить, что в ряде генов имеются короткие (обычно 15-30 п. н.) сегменты олиго(А). Они, естественно, присутствуют в про-мРНК, а иногда и в мРНК. Такие РНК тоже задерживаются при хроматографии, даже если они не содержат длинных поли (А), но их легко отделить, так как они элюируются с колонки в более мягких условиях, чем РНК с длинными поли (А) концами.

Другим важным методом, связанным с использованием поли (А), является обратная транскрипция мРНК. К смеси мРНК и ревертазы добавляют олиго (dT), выступающую в роли затравки. Олиго(dT) связывается с поли (А), и с 3'-конца олиго(dT) начинается синтез ДНК, комплементарной мРНК.

В заключение следует подчеркнуть, что не все мРНК содержат поли (А). Есть ряд исключений, наиболее ярким из которых являются мРНК, кодирующие гистоны. Почти все мРНК для гистонов не содержат поли (А) тракта на своем 3'-конце.

Кэп [63]. 5'-Конец мРНК тоже имеет особую структуру. Американский исследователь А. Шаткин обнаружил, что он содержит характерную химическую группировку, названную затем кэпом. Практически все молекулы про-мРНК и мРНК содержат кэп, или, как говорят, они "кэпированы". Первый этап кэпирования - это присоединение к 5'-концу РНК GTP. Последний (pppG) присоединяется фосфоэфирной связью к ферменту гуанилилтрансферазе, теряя пирофосфат: pppG+E→E∼pG+pp. Далее ферментный комплекс взаимодействует с трифосфорилированным 5'-концом растущей гяРНК, представленным обычно А или G (E~pG+pppNpN...→E+Gs'ppps'NpN...+р), т. е. трифосфатная группа взаимодействует по обеим сторонам с 5'-гидроксилом рибозы, и по обеим сторонам РНК оказываются свободные 3'-гидроксильные группы. Затем происходит метилирование гуанозина по 7'-положению.

Следующий этап - метилирование по 2'-положению рибозы между первым и вторым основаниями. В результате возникает следующая химическая группировка, устойчивая к действию ряда рибонуклеаз и щелочи: 7'meG5'ppp5'NrmpN..., которая, собственно, и называется кэпом. Иногда кэп может увеличиваться в размерах на один нуклеотид за счет метилирования еще одной рибозы (а также первого аденина): 7'meG5'pppArmpNrmpN... При обработке РНК щелочью или смесью рибонуклеаз образуется смесь 2', 3'-мононуклеотидов (Np) и устойчивые к этим обработкам кэпы, которые легко отделить хроматографически благодаря большим размерам и заряду. Очевидно, что кэп синтезируется посттранскрипционно, но это происходит настолько быстро, что большинство молекул про-мРНК оказывается кэпировано. По-видимому, ферменты кэпирования тесно связаны с РНК-полимеразой II, образуя единый комплекс, так что немедленно после начала транскрипции они осуществляют кэпирование 5'-конца новообразованной РНК.

Следует отметить, что не все синтезируемые в клеточном ядре РНК подвергаются кэпированию. Дело в том, что транскрипция разных генов идет при участии разных РНК-полимераз. Есть три разные РНК-полимеразы. РНК-полимераза I, находящаяся в ядрышке, отвечает за синтез про-рРНК, из которой затем образуется 28 и 18S рРНК. РНК-полимераза II синтезирует про-мРНК и некоторые малые РНК- Именно с РНК-полимеразой II связаны ферменты кэпирования, и только РНК, синтезированные РНК-Полимеразой II, кэпируются. Наконец, РНК-полимераза III отвечает за синтез 5S РНК, всех тРНК и ряда малых РНК. Как показал в нашей лаборатории Д. А. Крамеров, часть гяРНК также транскрибируется РНК-полимеразой III.

Транскрипты РНК-полимеразы I и III не кэпированы. Они содержат на 5'-конце просто трифосфатные группы (pppNpNpN.....). Почти все они (за рядом исключений) не подвергаются также и полиаденилированию.

Границы единицы траскрипции. Первичный транскрипт и его процессинг [64]. Те участки ДНК, по которым происходит кэпирование и которые соответствуют таким образом точкам начала транскрипции, называют "кэп-сайтами", или "сайтами кэпирования". Места, по которым происходит полиаденилирование, обозначают как "сайты полиаденилирования". Они соответствуют 3'-концам зрелых мРНК.

Если сайт кэпирования является местом, с которого начинается транскрипция, то сайт полиаденилирования не совпадает с точкой окончания транскрипции. РНК-полимераза II прочитывает ДНК за сайтом полиаденилирования, иногда проходя еще дистанцию длиной в несколько сот или даже тысяч нуклеотидных пар. Вскоре, однако, РНК разрезается, и по образовавшемуся новому 3'-концу происходит полиаденилирование. Остальная часть первичного транскрипта (за сайтом полиаденилирования) подвергается быстрому разрушению в ядре.

Таким образом, первичный транскрипт, или про-мРНК, подвергается в клеточном ядре целому ряду превращений. Происходит кэпирование его 5'-конца, созревание 3'-конца, заключающееся в расщеплении по сайту полиаденилирования, и затем само полиаденилирование. Наконец, происходит сплайсинг и удаление интронов. Эти процессы - кэпироваЦие, созревание 3'-конца, полиаденилирование и сплайсинг - в совокупности обозначаются как "процессинг про-мРНК", или "созревание мРНК".

Выше уже говорилось о том, что для сплайсинга необходимо наличие определенных нуклеотидных последовательностей на границе экзонов и интронов. Кэпирование протекает, очевидно, на любом 5'-конце РНК, синтезированном РНК-полимеразой И. Для созревания 3'-конца и его полиаденилирования требуются некоторые специфические нуклеотидные последовательности. Почти во всех мРНК за 15-30 нуклеотидов до полиаденилированного 3'-конца расположена последовательность AAUAAA. Изредка вместо нее выявляется AUUAAA. Последовательность AATAAA (AAUAAA) называют "сигналом для полиаденилирования". Перед точкой полиаденилирования или после нее часто лежит пентануклеотид CAYUG (Y - пиримидин, U - пурин нуклеотид). Наконец за сайтом полиаденилирования, начиная с 10-15-го нуклеотида, лежит последовательность, богатая G и T, которая важна для расщепления РНК по сайту полиаденилирования. Ее удаление, так же как и удаление AATAAA блока, ведет к нарушению созревания 3'-конца мРНК. Из вышеизложенного следует, что созревание мРНК из про-мРНК - это сложный многоступенчатый процесс, и ряд последовательностей в составе про-мРНК прямо используется для контроля соответствующих реакций.

Функция последовательностей, лежащих у 5'- и 3'-концов мРНК [65, 66]. Каждая мРНК состоит из трех частей: лидерной, или 5'-нетранслируемой, кодирующей и концевой, или 3'-нетранслируемой, последовательностей. Их длина варьирует в широких пределах. Обычно лидерная последовательность имеет в длину несколько десятков нуклеотидов, но бывают лидеры длиной в несколько сот нуклеотидов. Концевая последовательность, как правило, длиннее, от нескольких сот до тысячи и более нуклеотидов. Между ними лежит открытая рамка считывания, или кодирующая область.

Значение нетранслируемых последовательностей до конца не понято. Сам 5'-конец мРНК, несущий кэп, необходим для начала трансляции. Есть данные, что мРНК, где лидерная последовательность между кэпом и инициирующим кодоном в начале кодирующей зоны очень велика, транслируется плохо. Удаление значительной части лидера ведет к тому, что уровень трансляции существенно возрастает.

Нетранслируемая 3'-концевая последовательность, вероятно, тоже может выполнять функциональную нагрузку. Есть данные, что некоторые последовательности в ее составе, богатые Т (U), резко дестабилизируют мРНК, так что время жизни такой мРНК в цитоплазме оказывается очень небольшим. Удаление соответствующей области из гена резко удлиняет время жизни мРНК.

Наличие поли (А) на 3'-конце мРНК, видимо стабилизирует мРНК- Лишенные поли (А) РНК, хотя и траслируются, но время их жизни сокращается.

Таким образом, 5'- и 3'-нетранслируемым частям мРНК может принадлежать определенная роль в регуляции экспрессии генов на уровне синтеза белка, или трансляции. Однако для финальных выводов необходимы дополнительные исследования.

В следующем разделе мы рассмотрим вопрос о том, какие последовательности отвечают за определение начала (инициации) и окончания (терминации) транскрипции, а также за ее интенсивность и специфичность.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"