НОВОСТИ    БИБЛИОТЕКА    СЛОВАРЬ-СПРАВОЧНИК    КАРТА САЙТА    ССЫЛКИ    О САЙТЕ

предыдущая главасодержаниеследующая глава

4.4. Регуляторные белки, связывающиеся с энхансерами и другими контролирующими элементами генов

Литература: [181-186]

За последние годы стремительно накапливаются данные о существовании специфических белков, взаимодействующих с регуляторными областями различных генов.

К выявлению таких белков существуют различные подходы. Один из них - это детекция белка, связывающегося с определенной областью ДНК непосредственно в хроматине. Для этого в регуляторную область хроматина вносят разрыв с помощью той или иной эндонуклеазы, например с помощью рестриктазы, и от этой точки начинают гидролизовать ДНК экзонуклеазой. В том месте, где находится белок, связанный с ДНК, переваривание экзонуклеазой прекращается или резко замедляется. Ход гидролиза экзонуклеазой определяется электрофоретически по изменению размеров рестриктных фрагментов, гибридизующихся с соответствующей пробой. Таким образом удается определить границы области, занятой на ДНК тем или иным белком.

Другой подход - это выявление в ядерных экстрактах белков, способных специфически связываться с определенными участками ДНК. Для этого экстракты, выделяемые обычно из ядер с помощью 0,2-0,4 М солевых растворов, инкубируют с клонированными фрагментами меченой ДНК в присутствии избытка немеченой неспецифической ДНК (например, из E. coli). Комплексы ДНК с белками выявляют либо путем их сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах, либо наблюдая замедление миграции данного фрагмента при гель-электрофорезе. Зная рестриктный фрагмент, с которым специфически взаимодействуют белки ядерного экстракта, можно далее выявить участки этого фрагмента, защищаемые связанным белком от атаки нуклеазами (ДНКазой I, экзонуклеазой) или химическими агентами (например, диметилсульфатом). Для этого после мягкой обработки расщепляющими агентами фрагменты ДНК (меченные предварительно по одному концу) разделяют с помощью электрофореза в геле вместе с обработанными тем же методом препаратами свободной ДНК. Сравнивая полученные наборы продуктов расщепления, легко определить участки ДНК, защищаемые белком с точностью до одного нуклеотида (рис. 31).

Рис. 31. Защита участков ДНК специфически связывающимися белками от ДНКазы I. Опыты велись с фрагментом ДНК, содержащим область начала гена туе (ген, участвующий в регуляции размножения клеток) и лежащие перед ним участки ДНК, начинающиеся с сайта рестриктазы Alu I. Фрагменты были помечены [32Р] по 5'-концу в Alu-сайте. Их непосредственно обрабатывали малыми дозами ДНКазы I (1, 14) или перед обработкой ДНКазой I инкубировали с белками ядерного экстракта из клеток культуры эритробластов (HD3, 2-4), из клеток эритроцитов (Егу, 11 -13) или совместно двумя экстрактами (HD3-fEry, 5-10). В разных опытах брали разные количества белков, а также добавляли немеченую чужую ДНК в качестве конкурента. Полученные после обработки ДНКазой I препараты ДНК подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях и далее авторадиографии (а). Видно, что белки ядерных экстрактов защищают от атаки ДНКазой I разные области фрагмента, обозначаемые римскими цифрами (IV-VIII). Эти области отмечены на нуклеотидной последовательности фрагмента (б). Белки экстракта из эритроидных клеток связываются с зоной V, а из эритроцитов - с зонами IV, V, VI, VII и VIII (по результатам, полученным В. В. Лобаненковым и соавт.)
Рис. 31. Защита участков ДНК специфически связывающимися белками от ДНКазы I. Опыты велись с фрагментом ДНК, содержащим область начала гена туе (ген, участвующий в регуляции размножения клеток) и лежащие перед ним участки ДНК, начинающиеся с сайта рестриктазы Alu I. Фрагменты были помечены [32Р] по 5'-концу в Alu-сайте. Их непосредственно обрабатывали малыми дозами ДНКазы I (1, 14) или перед обработкой ДНКазой I инкубировали с белками ядерного экстракта из клеток культуры эритробластов (HD3, 2-4), из клеток эритроцитов (Егу, 11 -13) или совместно двумя экстрактами (HD3-fEry, 5-10). В разных опытах брали разные количества белков, а также добавляли немеченую чужую ДНК в качестве конкурента. Полученные после обработки ДНКазой I препараты ДНК подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях и далее авторадиографии (а). Видно, что белки ядерных экстрактов защищают от атаки ДНКазой I разные области фрагмента, обозначаемые римскими цифрами (IV-VIII). Эти области отмечены на нуклеотидной последовательности фрагмента (б). Белки экстракта из эритроидных клеток связываются с зоной V, а из эритроцитов - с зонами IV, V, VI, VII и VIII (по результатам, полученным В. В. Лобаненковым и соавт.)

Следующий этап эксперимента - это выделение белка на аффинных колонках, содержащих соответствующую ДНК- Этот этап необычайно труден, так как содержание белков, узнающих специфические последовательности ДНК, исключительно низкое. Между тем выделение белка пока является необходимым этапом как для изучения его биологической активности, так и для последующего клонирования, для которого надо или иметь антитела к белку, или знать последовательность какого-либо из его пептидов. Тогда можно выявить соответствующий клон либо иммуно-логически, либо гибридизацией с химически синтезированной олигонуклеотидной пробой.

Работа по этой схеме ведется во многих лабораториях, и достигнуты значительные успехи. Прежде всего, показано, что регуляторные области всех изученных генов содержат защищенные участки, отличные по организации от нуклеосом. Эти защищенные участки во многих случаях совпадают с консервативными областями, присутствующими во многих генах, мутации в которых существенным образом сказываются на работе гена. Сюда относятся ТАТА-блок, СААТ-блок и CCGCCC-блок, т. е. основные области промотора. В энхансерах защищенными во многих случаях опять-таки оказываются консервативные сердцевинные последовательности, составляющие основу модулей энхансеров.

Эти результаты были получены как в опытах по связыванию in vitro, так и при изучении защиты ДНК в составе хроматина. Интересно, что в последнем случае белки выявляются лишь в том случае, когда соответствующий ген транскрипционно активен. По крайней мере в ряде случаев гиперчувствительность активного гена к ДНКазе I может быть объяснена наличием специфических регуляторных белков. Они защищают блоки регуляторной зоны от ДНКазы I, оставляя в то же время небольшие отрезки ДНК экспонированными. Эти участки будут, естественно, атаковываться ферментами в первую очередь, и в них легко будут возникать близко расположенные разрывы в противоположных цепях, что приведет к двухцепочечному разрыву.

Все же, видимо, не вся гиперчувствительность к ДНКазе I может быть объяснена таким образом (см. разд. 4.5.).

Приведу несколько примеров. Одним из первых регуляторных белков был фактор транскрипции РНК-полимеразой III, открытый Д. Брауном (США) и названный им TFIIIA. Он специфически связывается с промоторной областью генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, и обеспечивает затем их непрерывную транскрипцию. Интересно, что гистон H1 препятствует связыванию TFIIIA и блокирует транскрипцию. Однако если комплекс уже образовался, то гистон H1 не способен вытеснять TFIIIA и на транскрипцию не влияет.

Изолирован еще ряд белков, связывающихся с распространенными по геному нуклеотидными последовательностями. Это белок Spl, взаимодействующий с CCGCCC-блоком, ядерный фактор, связывающийся с СААТ-блоком, и рецепторы стероидных гормонов, реагирующие с энхансерами зависимых от гормонов генов. Важно подчеркнуть, что в системах in vitro описанные белки часто обладают активирующим транскрипцию действием, что подтверждает их регуляторную функцию.

Что касается других регуляторных белков, в частности тех, которые узнают индивидуальные энхансеры, то их удается идентифицировать, но пока еще не удается получать в достаточных количествах. Тем не менее, поскольку проблема чисто техническая, она будет, несомненно, решена в ближайшем будущем, по крайней мере для тех систем, для которых получение исходного клеточного материала не является проблемой.

Кроме того, можно ожидать создания новых оригинальных систем отбора, которые позволят вести селекцию генов регуляторных белков на основании новых принципов. Уже сейчас, например, у дрозофилы известны супрессорные мутации, которые, очевидно, затрагивают гены регуляторных белков. Один из генов-супрессоров уже проклонирован, а другие, вероятно, будут проклонированы в ближайшее время. Таким образом, можно будет миновать длинный путь через изоляцию белков.

Итак, в настоящее время стремительно развиваются исследования белков, узнающих специфические последовательности ДНК и выполняющих функции регуляции транскрипции. Имеющийся материал еще недостаточен для обобщений и в любом случае эти обобщения быстро устареют. Ясно лишь, что именно на этом пути можно прежде всего ожидать решения многих вопросов о механизмах контроля активности гена, вопросов ключевых для понимания клеточной дифференцировки.

предыдущая главасодержаниеследующая глава






Ученые добавили две новые буквы в генетический код

В наших генах есть два «неандертальских процента»

Сколько у вас хромосом? История одной мутации

Инвестиции в редактирование генома

Распространение артритов объяснили исходом человека из Африки

Обнаружены гены, отвечающие за чувствительность к магнитному полю Земли

Вредные мутации в геноме усиливают влияние друг друга

Найдены 6 500 генов, отличающие мужчин от женщин

Антропологи извлекли ДНК древних людей из пещер без костных останков

Расшифровка генома ячменя принесла больше вопросов, чем ответов

Сибирские генетики сделали первые шаги к управлению фотосинтезом

Александр Баев – один из пионеров исследований генома человека

215 петабайт в одном грамме ДНК




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ 'Genetiku.ru: Генетика'

Рейтинг@Mail.ru