Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

I. Реакция

  1. H2O; объем = 20 мкл - (объем раствора ДНК, добавленного в пробирку от микрофуги).
  2. 2,5 мкл буфера NT для ник-трансляции 10×: 0,5 М трис (рН 7,5); 0,1 MMgSO4; 10 мМ ДТТ; 500 мкг/мл БСА.
  3. 2,5 мкл раствора, содержащего по 0,2 мМ всех dNTP, кроме того, который мечен 32Р.
  4. 0,5 мкг ДНК (или менее).
  5. 0,5 мкл разведенной ДНКазы (см. разд. III в данной методике).
  6. Перенесите эту реакционную смесь в пробирку от микрофуги, в которой находится dNTP, меченный 32Р (см. разд. II данной методики).
  7. 0,1 мкл раствора очищенной до гомогенности ДНК-полимеразы I E. coli с концентрацией 2 мг/мл.
  8. Инкубируйте около 3 ч при 14°С. Обычно реакция протекает следующим образом. В начальный период включения метки не происходит, затем следует быстрое линейное увеличение включения, замедление включения, плато, а затем, снижение количества включенной метки, причем иногда оно происходит быстро. Прекращайте реакцию на стадии замедленного роста включения или на стадии плато. В ДНК должно включиться по крайней мере 25% метки.
  9. Остановите реакцию. Добавьте 25 мкл раствора: 0,02 М Na3-ЭДТА. 2 мг/мл ДНК-носителя (обработанной ультразвуком тимусной ДНК); 0,2% ДСН.
предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"