Методика 25. Выделение ДНК из агарозного геля

I. Использование стеклянных фильтров

1. Для разделения нужных фрагментов ДНК проведите электрофорез в агарозном геле, используя трис-ацетатный или трис-фосфатный буфер (см. методику 20) с 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
2. Осветите длинноволновым УФ-светом лишь узкую полоску геля, чтобы УФ не повредил основной гель. Вырежьте из геля кусок, содержащий полосу ДНК.
3. К этому кусочку геля добавьте такое количество буфера РРЕ [6 М NaC1O₄, 50 мМ Na_1,5H_1,5PO₄ (pH 7), 10 мМ Na₃-ЭДТА], чтобы конечная концентрация NaC1O₄ была ≥ 5 М.
4. Такой препарат поместите на 37°С. Кусочек геля будет всплывать, так что пробирку с препаратом нужно периодически переворачивать. Для максимального выхода нужно, чтобы гель полностью растворился. Поэтому инкубируйте в течение 30-60 мин.
5. Поместите фильтр ватман GFC диаметром 8 мм в стеклянный аппарат для фильтрования. Включите слабый вакуум и автоматической пипеткой нанесите на фильтр GFC 1 мл буфера РРЕ. Подберите такое разряжение, чтобы скорость протекания была около 0,5 мл/мин.
6. Нанесите растворенный образец на фильтр GFC. Поддерживайте скорость протекания около 0,5 мл/мин.
7. Сполосните пробирку, в которой находился образец, 1 мл РРЕ и нанесите эту жидкость на фильтр.
8. Сполосните фильтр 1 мл РРЕ, а затем 2-3 мл 100%-ного этанола при комнатной температуре (скорость протекания при желании можно увеличить).
9. Удалите избыток жидкости, но не высушите фильтр.
10. Сложите фильтр в четыре раза. Положите его в пробирку от микрофуги на 0,5 мл, дно которой проколото иглой номер 27. Довольно плотно затолкайте фильтр на дно пробирки. Эту пробирку с фильтром поместите в пробирку от микрофуги на 1,5 мл со снятой крышкой.
11. Элюируйте ДНК с фильтра, добавив к нему 10-20 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис и 1 мМ Na₂-ЭДТА, рН 7,5). Оставьте фильтр намоченным примерно на 1 мин. После этого поместите пробирки в микрофугу и центрифугируйте в течение 15 с. В пробирке на 1,5 мл ДИК окажется на дне. Два раза добавляйте по 10-20 мкл ТЕ и центрифугируйте. Элюируемая в ТЕ ДНК расщепляется большинством рестриктирующих эндонуклеаз.

Буфер РРЕ: 6 М NaC1O₄, 50 мМ Na_1,5H_1,5PO₄ (рН 7), 10 мМ Na₃-ЭДТА.