III. Хранение ДНК

При обработке и хранении ДНК и РНК важно учитывать следующие свойства реактивов и условий.

1. Тяжелые металлы способствуют разрыву фосфодиэфирных связей.
2. Na₂-ЭДТА прекрасно хелатирует ионы тяжелых металлов.
3. При рН выше 7 цитрат уже не обладает буферной емкостью и лишь очень слабо хелатирует металлы. Цитрат используют по причинам чисто историческим, его использование не дает никаких преимуществ. Поэтому мы от него отказались.
4. При облучении и в результате химического расщепления образуются свободные радикалы. Они вызывают разрывы фосфодиэфирных связей.
5. УФ-лучи. Облучение светом с длиной волны 260 нм вызывает различные повреждения, в том числе приводит к образованию тиминовых димеров и поперечных сшивок. При этом падает биологическая активность. Облучение светом с длиной волны 320 нм также вызывает образование поперечных сшивок, но с меньшей эффективностью.
6. Диэтилпирокарбонат и диэтилоксидиформат. Эти соединения вызывают включение в одноцепочечные нуклеиновые кислоты карбэтоксильных групп, что приводит к утрате биологической активности. С двухцепочечными нуклеиновыми кислотами они, как правило, не реагируют при комнатной температуре.
7. Низкие значения рН вызывают депуринизацию, но этот процесс характеризуется высокой энергией активации.
8. Бромистый этидий вызывает фотоокисление ДНК при облучении ее видимым светом в присутствии молекулярного кислорода. Он хорошо захватывает свободные радикалы.
9. Фенол. Продукты его окисления могут вызывать разрывы фосфодиэфирных связей.
10. Эфир. Перекиси вызывают, по-видимому, разрывы фосфодиэфирных связей.
11. Формамид. Большинство водных растворов формамида со временем закисляется (до рН 5). Поскольку процесс катализируется щелочью, то лучше забуферить раствор формамида около рН 7 с помощью фосфата или PIPES. Если РНК находится в формамиде дольше нескольких дней, то в ней обнаруживается некоторое количество разрывов фосфодиэфирных связей.
12. Этанол. В отсутствие тяжелых металлов этанол не вызывает повреждений ДНК.
13. Нуклеазы. У людей на кожном покрове присутствуют нуклеазы. Поэтому старайтесь, чтобы пальцы не приходили в прямой или опосредованный контакт с нуклеиновыми кислотами. В большинстве своем ДНКазы не очень стабильны. Однако многие РНКазы чрезвычайно устойчивы. РНКаза может сорбироваться на стекле или пластике и оставаться при этом активной.
14. 5°С. Это одна из наиболее подходящих для хранения ДНК температур.
15. -20°С. При этой температуре происходит интенсивное образование одно- и двухцепочечных разрывов. Соль в растворах ДНК вымораживается, а точка замерзания насыщенного раствора соли примерно соответствует тем температурам, которые получаются в большинстве морозильных камер при их циклической работе. В результате ДНК подвергается многократным циклам замораживания - оттаивания.
16. -70°С. Это, по-видимому, лучшая температура для длительного хранения. Помните, однако, что в замороженном состоянии повреждающее действие свободных радикалов может быть гораздо выше.

Хранить ДНК в течение длительного времени лучше всего в растворах с высокой концентрацией соли (≥1 М), высокой концентрацией Na₂-ЭДТА (≥10 мМ) при рН 8,5 (трис-буфер).

Очень хорошо хранить ДНК в растворе CsCl с бромистым этидием, плотность которого соответствует плавучей плотности ДНК, при 5°С в темноте (завернув сосуд в алюминиевую фольгу). При этих условиях за год происходит разрыв примерно одной фосфодиэфирной связи на 200 kb ДНК.

ДНК фага λ лучше сохраняется в частицах фага, чем в виде очищенной ДНК. В фаговых частицах в растворе CsCl с плотностью, соответствующей плавучей плотности фага, ДНК может храниться в течение 5 лет, и при этом не выявляется каких-либо ее повреждений (менее одного разрыва на 200 kb).