1.1. Анализ случайной выборки спор

Для количественного изучения мейотического расщепления микроорганизмов необходимо выделить их гаплоидные продукты мейоза (аскоспоры, базидиоспоры), прорастить и учесть фенотипы развившихся из них культур. При этом могут возникать практические трудности в связи с необходимостью собрать значительную массу спор, не загрязненную вегетативными клетками родительских форм или гибридных диплоидов. Для этого поступают по-разному, в зависимости оттого, какой микроорганизм изучают. У Neurospora аскоспоры при созревании выбрасываются из плодовых тел, и если чашка с культурой гриба перевернута, они высыпаются на крышку. Отсюда их легко смыть, а затем полученную суспензию высеять. Прорастают аскоспоры лишь при кратковременном прогревании, а вегетативные клетки не выносят высокой температуры, и если они случайно оказываются в суспензии, то погибают. Выдерживание спорулирующей культуры дрожжей Schizosaccharomyces и Saccharomyces в спирте специально подобранной концентрации также убивает родительские или гибридные диплоидные клетки, но оставляет живыми аскоспоры. Посев обработанной таким образом суспензии дает колонии, происходящие только от аскоспор.

Отделение спор от вегетативных клеток у грибов может быть осуществлено также чисто генетическими методами, в частности, с помощью специально выбранных наследственных признаков (селекторов) для различения клонов, которые произошли от продуктов мейоза, и клонов, которые берут начало от вегетативных клеток. Примером может служить обычная система отбора гибридных аскоспор у аспергилла. В качестве партнеров для скрещивания берут штаммы с неидентичными биохимическими потребностями, например, pyro⁺phen (потребность в фенилаланине) и pyro phen⁺ (потребность в пиридоксине). Среди аскоспор в равном количестве присутствуют генотипы pyro⁺phen, pyro phen⁺, pyro phen, pyro⁺phen⁺. При посеве клеток на минимальную среду прорастают лишь аскоспоры pyro⁺phen⁺, а остальные 75 % аскоспор, как и родительские клетки, не образуют колоний. При этом если произошло расщепление и по третьему гену (например, у⁺/у - зеленая или желтая окраска колонии), то среди отобранных 25 % потомства соотношение у⁺ : у составит 1:1, как и во всей совокупности аскоспор (условие: все рассматриваемые гены не сцеплены). Следовательно, у части потомства, отделенной с помощью селекторов, возможен анализ расщепления по другим генам, в частности по генам так называемых неселектируемых признаков.

Рассмотрим характер расщепления в мейотическом потомстве независимо от того, каким образом это потомство было отобрано. Напомним, что при мейозе гомологичные хромосомы, происходящие от разных родителей, конъюгируют, а затем расходятся к противоположным полюсам, в результате чего образуются гаплоидные клетки. На каждую такую клетку-спору с хромосомой первого родителя должна приходиться одна спора, содержащая хромосому второго. Если родительские формы отличались каким-то признаком, обусловленным аллелями А и а, то в результате расхождения хромосом (одной с А, другой с a) гибридный диплоид A/a даст после мейоза половину спор с аллелью А, половину - с аллелью а. Расщепление 1:1 по какому-либо признаку наблюдается в тех случаях, когда этот признак детерминирован одним геном, расщепляющимся в мейозе с хромосомами.

Если родители отличаются несколькими парами признаков и каждый обусловлен одним ядерным геном, то в простейшем случае дигибридного скрещивания (зигота А/а, B/b) в потомстве возникают четыре класса генотипов, соотношение которых составит 1:1:1:1 при условии, что гены А и В располагаются в разных, не гомологичных хромосомах, перераспределяющихся в мейозе.

Если же два рассматриваемых гена являются участками одной хромосомы, т. е. сцеплены, то можно ожидать расщепление 1АВ : 1ab. В большинстве же случаев, однако, наряду с родительскими сочетаниями генов АВ и ab возникают (хотя и меньше) комбинации Аb и аВ, т. е. наблюдается рекомбинация сцепленных генов. Рекомбинация является результатом кроссинговера - обмена участками между гомологичными хромосомами в профазе мейоза. Кроссинговер происходит примерно с одинаковой вероятностью в любой точке по длине хромосомы. Однако если гены рассматриваются попарно (например, А и В, С и D) и если первые из них расположены близко друг к другу, а вторые удалены, то между вторыми кроссинговер будет происходить гораздо чаще, чем между первыми. Поэтому при изучении расщепления минимум по трем сцепленным генам появляется возможность их картирования, т. е. размещения в хромосоме в линейном порядке. Частота кроссинговера, о которой судят по частоте рекомбинации генов в потомстве, является мерой расстояния генов в хромосоме.

Если частоту рекомбинации генов А и В обозначить r_AB, генов В и С - r_BC, и A и С - где и если r_АС = r_АB + r_BC, то порядок генов будет А - В - С, если же r_АС = r_АВ - r_BC, то порядок будет А - С - В.

В скрещиваниях аллели рассматриваемой пары генов могут находиться в так называемой фазе притяжения (coupling) или фазе отталкивания (repultion), ab x AB или aB x Ab соответственно. В первом случае рекомбинантные классы в потомстве Аb и аВ, во втором - АВ и ab. Отношение их числа к общему числу потомков дает частоту рекомбинации, или меру сцепления генов, при условии, что все классы потомства характеризуются одинаковой жизнеспособностью. Примером могут служить данные, представленные в табл. 1.1. Мутант Neurospora crassa с измененной морфологией колоний и без макроконидий col-1 скрещен с двумя ауксотрофами pan и pdx. В каждом случае наблюдалось отклонение от соотношения 1 : 1 (проверяется методом χ²), но на жизнеспособность изучаемые гены заметного влияния не оказывают. Из этого можно сделать следующие два вывода:

1-й - гены col-1 и pan, для которых рекомбинанты не обнаружены, тесно сцеплены;

2-й - гены col-1 и pdx сцеплены, а частота рекомбинации составляет 48/(176 + 48) ⋅ 100 = 21,4 %.

Таблица 1.1. Расщепление в потомстве гибридов нейроспоры, полученных при скрещивании двух мутантов [10]