3.1.3. Рекомбинационный анализ трансконъюгантов на наследование неселективных маркеров

Иногда невозможно провести прямую селекцию некоторых маркеров донора или уловить количественное различие между ними в конкретных опытах скрещивания. В этих случаях приемлем классический рекомбинационный анализ, который с одинаковым успехом применяется у бактерий и эукариотов и является высокоэффективным методом картирования мутаций на внутри- и межгенном уровнях. После скрещивания, не прерываемого во времени, образцы смеси клеток высевают на среду, селективную для поздно переносимого маркера донора (дистальный маркер) и не селективную для всех остальных маркеров, расположенных между точкой начала переноса и селектируемым маркером (проксимальные маркеры). Наиболее дистальный маркер используется для контрселекции клеток донора.

Обычно пересевают (петлей или зубочисткой) 100-200 колоний трансконъюгантов данного типа на матричную чашку (с той же селективной средой) в виде регулярных пятен или квадратиков, которая после инкубации перепечатывается методом реплик на ряд диагностических сред для идентификации неселективных маркеров и установления генотипа рекомбинантов. При скрещивании между штаммами Hfr х F^-, генотипы которых приведены в параграфе 3.1.1, необходимо выбрать и очистить от 200 до 400 трансконъюгантов и затем проверить их на наследование маркеров донора аrа⁺, lеu⁺, рrоА⁺, lac⁺, рurЕ⁺. Практически трансконъюганты Trp+Nal^r высеянные на матричную чашку, последовательно перепечатывают на минимальные агаризованные среды, которые являются селективными для трансконъюгантов Ara+Trp+Nal^r, Leu+Trp+Nal^r, Pro+Trp+Nal^r, Lac+Trp+Nal^r, Ade+Trp+Nal^r и Trp+Nal^r.

Пример рекомбинационного анализа приведен в табл. 3.2. При скрещивании бактерий в отличие от скрещивания эукариотов образуется мерозигота, в которой возникают два дополнительных перекреста в наружных интервалах х и у. Наблюдается линейный градиент частот аллелей родителей и оба члена пар комплементарных генотипов. Один из членов пары представлен меньшим числом из-за необходимости дополнительных перекрестов. Соблюдается главный принцип картирования - обратная зависимость частоты генотипов от числа перекрестов. Генотипы, возникшие в результате четверных кроссинговеров, представлены меньшим числом по сравнению с генотипами, требующими перекрестов в двух интервалах.

Таблица 3.2. Рекомбинационный анализ Е. coli К-12 [20]

(Примечание. Вверху представлено процентное соотношение аллелей родителей в рекомбинантном потомстве. Треугольники - селектируемые аллели.)

Анализ данных скрещивания осложняется из-за возможности множественных кроссинговеров, искажающих истинное расстояние между маркерами. Как видно из табл. 3.2, нельзя считать возникновение четырех пар комплементарных генотипов в отношении трех неселектируемых маркеров следствием перекрестов в интервалах 2 и 3, так как для их возникновения необходимы дополнительные кроссинговеры в областях х и у. Один из подходов, игнорирующих указанную интерференцию,- определение относительных длин интервалов 1, 2 и 3 на основании частот трех простых классов рекомбинантов, возникших путем кроссинговеров в интервалах х, 1, х, 2 и х, 3. Эти частоты будут: 242 : 1512 = 0,16; 66 : 1512 = 0,44 и 337 : 1512 = = 0,22. Доля рекомбинантов, возникших вследствие перекрестов в областях 1, 2 и 3, составляет соответственно 0,16, 0,44 и 0,22 общего числа рекомбинантов.

В приведенном расчете допускается минимум предположений и используется только часть полученных данных. Verhoef и de Haan [39] предложили математическую обработку всех данных для определения относительных расстояний на карте. Эти расстояния очень напоминают пропорцию классов простых кроссинговеров и соответствуют данным, полученным с помощью анализа времени переноса. Если известен интервал карты в минутах, то можно вычислить расстояние в единицах рекомбинации. Рекомбинационный анализ использован для изучения тонкой генетической структуры области lac [2].