3.1.4. Картирование любого гена с помощью polA - зависимых плазмид

Данный метод, разработанный Greener и Hill [19], позволяет картировать любые гены, в том числе с еще не установленным фенотипом, у Е. coli К-12. Метод основан на использовании СоlE1-производных плазмид pBR313 или pBR322 [17], требующих для репликации наличия в клетках ДНК- полимеразы I подобно исходной плазмиде. Фрагмент хромосомной ДНК или ген, подлежащие картированию, включают в состав указанных плазмид по соответствующим сайтам рестрикций (например, по HindIII, SalI и др.) и полученные рекомбинантные плазмиды вводят в клетки реципиента polA методом трансформации с отбором трансформированных клонов по селектируемым маркерам плазмид. Такие антибиотикоустойчивые клоны трансформантов возникают, если плазмида интегрируется в хромосому клетки в области гомологии ДНК, представленной картируемым фрагментом или геном. Автономная плазмида в отсутствие ДНК-полимеразы I не реплицируется в клетке и затем элиминируется. Полученные трансформанты Hfr polA Аmp^r используют как доноры в скрещиваниях со штаммами F^-Amp^S для определения времени вхождения гена устойчивости к ампициллину (Аmp^r), тесно сцепленного с картируемым геном.

Для более тонкого картирования неизвестного гена применяют метод трансдукции с помощью фага Р1. Таким способом определяют процент котрансдукции гена с соседним известным маркером. С помощью данного метода были картированы у Е. coli новый генетический элемент е14 [19], ген pheU фенилаланиновой тРНК [17] и др.