3.4. Слияние протопластов

Генетическая рекомбинация путем искусственного приготовления и слияния протопластов грамположительных бактерий открыта недавно (1976-1977) по сравнению с генетическими исследованиями продуктов слияния клеток животных. В настоящее время метод слияния протопластов все чаще используется в разных лабораториях мира для достижения различных целей: изучения генетического взаимодействия полноценных геномов, получения внутри- и межвидовых гибридов, установления сцепления и экспрессии генов и их картирования, трансформации хромосомной и плазмидной ДНК и трансфекции, клонирования генов, переноса плазмид от одного штамма к другому и их элиминации при изучении внехромосомной наследственности, селекции промышленных штаммов. Метод слияния протопластов имеет определенные преимущества перед известными традиционными способами переноса генетического материала у микроорганизмов - конъюгацией, трансдукцией и трансформацией. Главными достоинствами метода слияния протопластов являются: возможность осуществления генетической рекомбинации у бактерий, не имеющих хорошо развитой системы генетического обмена - конъюгации; обеспечение генетического взаимодействия целых геномов в отличие от конъюгации, трансдукции и трансформации, приводящих к образованию мерозиготы; повышение эффективности систем трансформации и трансфекции.

Слияние протопластов более эффективно применяется в настоящее время у грамположительных микроорганизмов по сравнению с грамотрицательными, так как внешняя мембрана последних создает трудности при получении истинных протопластов. Индуцированная полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформация протопластов с помощью плазмидной ДНК выгодно отличается от трансформации компетентных клеток сенной палочки своей эффективностью. Кроме того, трансформация протопластов возможна также с помощью хромосомной ДНК, инкапсулированной в липосомы, что особенно важно для тех бактерий, у которых не обнаружено обычной системы трансформации.

Получение протопластов. У грамположительных бактерий В. subtilis и В. megaterium клетки легко превращаются в протопласты простой обработкой лизоцимом, а у стафилококков - лизостафином. Мицелиальные микроорганизмы стрептомицеты становятся более чувствительными к действию лизоцима после предварительного выращивания в жидкой среде в присутствии субтоксических концентраций глицина (0,8-3,5 %), заменяющего остатки D-аланина в пептидогликане и нарушающего поперечные сшивки между молекулами в последнем. Чем моложе клетки, тем они чувствительнее к лизоциму. Для получения протопластов у грибов, клеточная стенка которых содержит хитин, применяют комплексный ферментный препарат из пищеварительного сока виноградной улитки. Клетки грамотрицательных микроорганизмов выращивают на глицине, обрабатывают лизоцимом и ЭДТА для устранения внешней мембраны и превращения сферопласта в истинный протопласт. Иногда используют антибиотик фосфомицин, который ингибирует синтез клеточной стенки. Протопласты получают в гипертонической среде с применением в качестве стабилизаторов сахарозы, сукцината и других компонентов.

Регенерация протопластов. Использование методов слияния или трансформации протопластов для генетического анализа микроорганизмов предусматривает успешную регенерацию протопластов в клеточные формы и культуры с целью получения рекомбинантного потомства или трансформированных клонов. Для определения частоты регенерации протопластов необходимы данные о титре протопластов, высеянных на регенерационную среду, и числе колоний, возникших из регенерированных протопластов. Число протопластов определяют с помощью гемоцитометра (камеры Горяева) и фазово-контрастной микроскопии. Непротопластированные клетки, или сферопласты, с уцелевшей клеточной стенкой в отличие от истинных протопластов устойчивы к осмотическому шоку и поэтому их численность легко можно определить путем разведения протопластов дистиллированной водой и высева их на обычную изотоническую среду без стабилизаторов (0,3 М сахарозы). Для каждой группы микроорганизмов разработаны оптимальные среды для эффективной регенерации протопластов. Протопласты сенной палочки высевают на гипертоническую среду, содержащую 1 % сывороточного альбумина. В регенерационную среду добавляют желатин. В таких условиях регенерация протопластов бацилл достигает 100 %.

Кроме оптимизации регенерационной среды по компонентному составу, важную роль в регенерации протопластов играет также возраст культуры и физиологические условия выращивания. Необходимо отметить, что для каждого штамма бактерий нужно подбирать индивидуально оптимальные условия для регенерации протопластов.