3.4.1. Взаимодействие геномов после слияния протопластов

Полиэтиленгликоль - универсальный фюзогенный фактор, используемый для слияния протопластов растений, животных и микроорганизмов. Молекулярная масса и концентрация ПЭГ имеют большое значение для слияния протопластов. Обычно применяют ПЭГ с молекулярной массой от 1000 до 6000 в концентрации 50 %. Обработка протопластов ПЭГ проводится 1-2 мин при комнатной температуре. Сливаться могут 2, 3 и больше протопластов с образованием клеточной единицы, содержащей эквивалентное число ядер. Молекулы ДНК объединенных ядер могут вступать последовательно в генетическую рекомбинацию с возникновением разных типов рекомбинантов и их сегрегацией при формировании и росте колоний регенерантов. Возможно также длительное диплоидное состояние гибридов (гетерокарионы) и их расщепление на исходные родительские типы.

Существуют разные методы количественного учета генетических рекомбинантов после слияния протопластов: 1) прямая селекция рекомбинантов на регенерационной среде; 2) непрямая селекция рекомбинантов методом отпечатков колоний из неселективной регенерационной среды на ряд селективных сред; 3) анализ рекомбинантов в одиночных колониях, регенерированных в неселективных условиях; 4) анализ рекомбинантов в массовых культурах, регенерированных в неселективных условиях. Перечисленные методы не дают одинаково точного определения частоты рекомбинации по ряду причин. Прямая селекция учитывает не все возможные классы реком-бинантов и подобно методу отпечатков колоний, возникших в неселективных условиях, на диагностические среды оставляет вне поля зрения еще не образовавшиеся потенциальные рекомбинанты. Только неселективный анализ клеток индивидуальных колоний на наличие рекомбинантов дает наиболее точную информацию о событиях, происходящих после слияния протопластов - комплементации, рекомбинации и сегрегации.

В зависимости от условий регенерации протопластов и выделения рекомбинантов у В. subtilis описано несколько типов клонов, различающихся по плоидности, стабильности и экспрессии геномов: 1) фенотипически рекомбинантные клоны [33, 36]; 2) комплементирующие диплоиды (CD) [27]; 3) некомплементирующие диплоиды (NCD), или двуродительские колонии (biparental, BP) [25]; 4) гаплоидные рекомбинанты.

На богатых и неселективных регенерационных средах возникают в большинстве клоны фенотипических рекомбинантов (0,5-2,0 %), некомплементирующие диплоиды (до 10 %) и редко - комплементирующие диплоиды. На минимальных селективных регенерационных средах вырастают главным образом комплементирующие диплоиды и рекомбинантные классы. Комплементирующие и некомплементирующие диплоиды являются гетеродиплоидами, выщепляющими разные сегреганты. Фенотипически стабильные рекомбинантные клоны, выделенные непосредственно из регенерированных колоний или в качестве сегрегантов CD-клонов, возникают независимо от rесN⁺ - гена как результат нереципрокных рекомбинаций, происходящих главным образом в районах начала и терминации репликации хромосомы.

Фенотипически рекомбинантные клоны диплоидны, о чем свидетельствует их гетерозиготность по многим (8-10) локусам, разбросанным по всей хромосоме, установленная с помощью трансформирующей активности ДНК. Предполагается, что фенотипически стабильные рекомбинанты возникают путем генетической инактивации одной целой рекомбинантной хромосомы или части одной из хромосом родителей [33].

Таким образом, генетическая стабильность еще не является строгим доказательством гаплоидного состояния рекомбинантных клонов, образованных после слияния протопластов сенной палочки. При данном способе неполовой гибридизации клеток бацилл возникают и стабильные гаплоидные рекомбинанты, природу которых нужно подтвердить генетическими тестами.

Клоны некомплементирующих диплоидов возникают с частотой до 10 % числа регенерантов и, по-видимому, отражают физическую картину слияния. Они содержат две хромосомы, из которых только одна экспрессируется в каждом конкретном клоне Супрессии подвергаются нормально доминирующие маркеры чувствительности к антибиотикам, которые можно обнаружить у диплоидов с помощью испытания трансформирующей активности их ДНК на соответствующем реципиенте [25].

В работе [16] более тщательному генетическому анализу подвергнуты некомплементирующие диплоиды. Анализ их потомства показал, что эти клоны ведут себя как мультипотенциальные системы, дающие полностью реципрокные (по 8-11 генам) рекомбинанты, часто сопровождаемые одним или обоими родителями и достигающими 10-30 % всех рекомбинантов. Из приведенных данных следует, что целые геномы родителей в диплоидном протопласте ведут себя как независимые репликоны, подвергаясь классической рекомбинации, характерной для гаметогенеза эукариотов Родительские или рекомбинантные геномы могут участвовать в множественных раундах рекомбинации, часто нереципрокной, без последующей сегрегации геномов. Подавление экспрессии родительской или рекомбинантной хромосомы не связано с рекомбинацией. Авторы наблюдали также увеличение частоты кроссинговеров в областях начала и терминации репликации хромосомы, что можно объяснить связью указанных сайтов хромосомы с мембраной и стенкой клетки.