3.4.2. Картирование хромосомы

Взаимодействие целых хромосом после слияния протопластов и выделение большого числа разнообразных рекомбинантов дают возможность установить сцепление генов по всей кольцевой карте генома, несмотря на более частое возникновение кроссинговеров на единицу длины карты в областях начала и конца хромосомы. Картирование неизвестного маркера или установление правильной ориентации отдельных групп сцепления относительно друг друга на кольцевой карте осуществляется с помощью обычного и общего критерия, применяемого при конъюгации, трансдукции и трансформации,- минимума множественных кроссинговеров при выборе правильной последовательности маркеров. Рекомбинанты, унаследовавшие по одному селектируемому маркеру родителей, выделяют на селективной среде, а затем классифицируют по принципу наследования неселективных маркеров.

Возможность применения метода слияния протопластов для картирования хромосомы В. subtilis показано также в работах [16, 33]. Здесь также соблюдался принцип минимума множественных кроссинговеров при анализе рекомбинантного потомства при 8-11-факториальном слиянии протопластов.

Указанный принцип успешно использован при картировании хромосомы Staphylococcus aureus, где анализ множественных рекомбинантных типов был облегчен применением компьютера [37]. В среду регенерации вносили 2,5 % агара и 0,3 % крахмала, что обеспечивало регенерацию протопластов с частотой 1 %. В скрещивания-слияния было вовлечено 9-10 факторов. Из колоний, выросших на неселективной регенерационной среде, готовили суспензию клеток в изотоническом солевом растворе, обрабатывали ультразвуком с целью разобщения агрегированных клеток и высевали на соответствующие селективные среды для выделения рекомбинантов. В роли селектируемых маркеров использовали по одной детерминанте устойчивости к антибиотикам каждого родителя. Полученные таким образом рекомбинантные клоны были стабильными и гомогенными по неселективным маркерам, т. е. являлись гаплоидными рекомбинантами. При субклонировании рекомбинанты были стабильными и вели себя как истинные гаплоиды в роли доноров и реципиентов при трансформации. Среди колоний регенерантов, выделенных в неселективных условиях, частота рекомбинантных колоний составляла до 6,0 %. Для каждой пары маркеров, включая селектируемые, определяли частоту совместного наследования (их процент общего числа рекомбинантов, обладающих родительской комбинацией данной пары маркеров), на основании которой был предложен порядок расположения маркеров на карте. Данный порядок вводился в компьютер, вычислялось минимальное число необходимых для возникновения каждого фенотипа множественных кроссинговеров совместно с общим числом кроссинговеров опыта. Совместное наследование двух любых маркеров от каждого родителя является приблизительной функцией их относительного расположения на хромосоме. Результаты картирования методом слияния протопластов были подтверждены в опытах трансформации. Метод слияния протопластов дал возможность объединить в одну кольцевую карту генома разобщенные группы сцепления.