Глава 2. Первый "генный инженер" - природа
- Где же у тебя смерть, Кашей Бессмертный? - У меня смерть, - говорит он, - в таком-то месте: там стоит дуб, под дубом ящик, в ящике заяц, в зайце утка, в утке яйцо, в яйце моя смерть.
Раком болеют не только люди и животные, но и растения. Это грустное обстоятельство известно было еще Аристотелю, давшему первое научное описание болезни растений, известной как "корончатый галл". Наверное, многим приходилось видеть такие опухоли, имеющие вид грубых наростов, галлов, образующихся на прикорневой части стебля (у корневой шейки, отсюда и слово "корончатый"), на подземных (у яблонь, например, на корнях) и наземных (у винограда часто на стеблях) частях растений, а у привитых растений - на месте стыка между привоем и подвоем. Корончатые галлы - настоящая злокачественная опухоль. Ее клетки беспорядочно делятся, утрачивают тканевую специфичность. Такие клетки называют дедифференцированными. Опухолевая ткань, которую они образуют, аморфна. Это значит, что нельзя определить, откуда произошла эта ткань - из корня, листа или стебля. Как и подобает типичным опухолевым клеткам, клетки корончатых галлов способны распространяться по растению от первичного очага возникновения и давать начало вторичным опухолям - метастазам. Растения, на которых образовались галлы, начинают отставать в росте, часто подсыхают, урожайность их резко падает, а чувствительность к неблагоприятным условиям растет. Болезнь поражает свыше 600 видов почти исключительно двудольных, то есть имеющих два зародышевых листа, растений. Тут и виноград, плодовые, лесные и декоративные породы деревьев и кустарников, цитрусовые, чайные кусты, хмель, томаты, бобовые, свекла, малина, гвоздика, хризантемы и многие другие культуры. В некоторые сезоны потери их урожая достигают 50 - 70 процентов. От галлов несут убытки земледельцы и садоводы Австралии, Англии, Болгарии, Испании, Финляндии, ФРГ, некоторых африканских стран. У нас больше всего страдают виноградная лоза и плодовые.
С чем же связана эта долгое время остававшаяся загадочной болезнь? "Пионерами" планомерного исследования природы корончатых галлов стали два знаменитых ученых - американский фитопатолог Эрвин Смит и датский ветеринар и онколог Карл Йенсен, работавшие на рубеже прошлого и нынешнего веков. Э. Смит первым привел серьезные доказательства того, что корончатые галлы - это рак растений, и пришел к выводу, что изучение этой болезни может стать моделью для изучения природы опухолевого роста как фундаментального биологического процесса, распространенного у различных видов живых организмов. Эта идея Смита была подхвачена и углублена Йенсеном, увидевшим немало общего между корончатогалловыми опухолями у растений и раком у животных. К тому времени удалось выявить и возбудителя корончатых галлов. Им оказалась бактерия, выделенная еще в 1897 году Ф. Каварой из опухоли винограда. Прошло еще десяток лет, прежде чем Э. Смит и К. Таусенд показали, что если этой бактерией, являющейся частым обитателем ризосферы, заразить здоровое, но пораненное растение, то вскоре на нем в области раны разовьется типичный корончатый галл. Названий у этой бактерии было несколько, но прижилось нынешнее - Agrobacterium tumefaciens, что буквально означает "полевая бактерия, вызывающая рак". Мы не зря так подробно остановились на "анкетных данных". Имя этой бактерии еще много раз встретится на страницах нашей книги, ведь именно с ней связаны рождение, становление и основные нынешние успехи генной инженерии растений. Но это все будет потом, а пока вернемся почти на полвека назад, к 40-м годам, когда начал исследование корончатых галлов американский ученый Армии Браун. Браун добился успеха в культивировании тканей галла на искусственной среде, содержащей только сахарозу и неорганические соли. Он первым сделал два важнейших наблюдения о свойствах опухоли. Во-первых, оказалось, что в отличие от нормальных клеток или тканей растений, способных, хотя и медленно, расти в культуре лишь в присутствии стимуляторов роста растений - фитогормонов ауксина и цитокинина, опухолевые клетки растут в культуре довольно быстро и не нуждаются в добавлении фитогормонов. Во-вторых, выяснилось, что для того, чтобы опухоль возникла, достаточно даже кратковременного контакта бактерий с растением, само ее развитие происходит и в их отсутствие. Это значит, что после того как бактериальная инфекция индуцировала, то есть запустила опухолевый процесс, безудержное размножение опухолевых клеток, а как следствие, и бесконтрольный рост опухолевых тканей происходят уже независимо от бактерий. На основании этих наблюдений Браун постулировал, что под воздействием бактерий нормальные клетки каким-то образом претерпевают онкотрансформацию, превращаясь в опухолевые. Другая мысль Брауна заключалась в следующем: вероятно, бактерии продуцируют некий внеклеточный фактор, ответственный только за индукцию опухолей, но не за ее последующее развитие. Этот фактор так и был назван TIP (от английского tumor-inducing princip, то есть тумор-индуцирующий принцип). Что собой представляет TIP, было непонятно, но не вызывало сомнений - он проникает в нормальную растительную клетку и за сравнительно короткое время, примерно в 30 часов, превращает ее в опухолевую.
Раскрыть природу TIP стало главной задачей ученых, изучающих корончатые галлы. Удалось это лишь в середине 70-х годов, но и в промежутке почти в три десятилетия - от времени формулирования представлений о существовании внеклеточного "тумор-индуцирующего принципа" до расшифровки его молекулярной сущности - было сделано несколько важных наблюдений о том, как происходит опухолевая трансформация растений и какие особенности отличают опухолевые клетки от нормальных.
Выяснилось, что воротами для инфекции служат даже мелкие ранки на поверхности растений. Они могут возникнуть при неосторожной агротехнической обработке, вследствие заморозков, при прививках. Удалось проследить некоторые детали развития болезни от момента встречи растений с бактерией до появления опухоли.
Но, пожалуй, главными наряду с постулированием существования TIP стали открытия, сделанные в 60-х годах французским ученым Г. Моррелем и его коллегами из Национального института агрономических исследований в Версале. В тканях корончатых галлов ими был обнаружен не известный ранее класс веществ, названных "опины". Это слово объединило низкомолекулярные соединения различного происхождения. Большинство опинов - необычные производные некоторых аминокислот. Особенно часто встречаются два производных аргинина - октопин и нопалин. Бывают опины углеводного происхождения. К ним относятся агропин и агроцинопин. Есть и другие типы опинов. Все опины объединяет один общий признак - обнаруживаются они только в тканях опухолей. В нормальных клетках найти опины не удается.
Определяют, какой опин будет синтезироваться в клетках данной корончатогалловой опухоли, не растения, на которых она образовалась, а вызвавшие ее патогенные агробактерии. Французские ученые смогли ответить на вопрос, зачем нужны опины? Действительно, опины не требуются ни для возникновения опухоли, ни для ее последующего роста и развития. Так для чего же они? Оказалось, опины поедаются бактериями, причем эти микроскопические существа довольно разборчивы. Каждый штамм агробактерии (а слово штамм, как вы помните, означает то же, что и знакомое нам слово "клон", то есть потомство одной клетки) способен использовать в пищу в качестве единственного источника углерода и азота, этих основных строителей белков и нуклеиновых кислот, именно тот опин, который синтезируется в опухоли, вызванной данным штаммом.
Настоящий ученый тот, кто не только способен обнаружить новый факт, но и может подвести под него теоретическое обоснование. Этим качеством в полной мере обладал рано ушедший из жизни Моррель, который установил, что ни в трансформированных клетках растений, ни в клетках стерильной опухолевой ткани, культивируемой in vitro, живых бактерий обнаружить не удается. Моррель сделал смелое предположение: опины - это продукты генов, которые бактерия вводит в растение. Это означало, во-первых, что в основе возникновения корончатых галлов лежит истинная генетическая трансформация, вроде той, что была хорошо известна в мире бактерий еще со времени опытов Гриффита, а потом и Эйвери с его коллегами. А во-вторых, и это второе станет на самом деле главным для всей будущей генной инженерии растений, генетическая информация может переноситься в растения от бактерий. Но до появления генной инженерии растений оставалось еще почти 20 лет, а пока ученые, интересующиеся загадкой корончатого галла, решили раскрыть тайну TIP.
Претендентов на звание TIP было несколько. Главными некоторое время оставались вирусы бактерий - бактериофаги. Генетики микроорганизмов, а именно из их числа вышли многие видные исследователи бактериального рака растений, как часто величают корончатые галлы, хорошо знали такое явление, как трансдукция. Многие бактериофаги, размножаясь в бактериальной клетке, прежде чем окончательно погубить свою жертву, выхватывают из ее хромосомы частички ДНК и "прячут" их под своей белковой одежкой. Заразив следующую клетку, "фаг-воришка" сбрасывает "награбленное", и если для прихваченной ДНК найдется в хромосоме нового хозяина похожая последовательность нуклеотидов, то в этом месте ДНК из первой клетки (донора) может встроиться в хромосому второй (реципиента). Фаг же переносчик может поплатиться за свою "нечестность" - он часто становится дефектным и не разрушает клетку реципиента, а вроде как приживается в ней вместе с "поклажей". Такую клетку, в которой "затаился" фаг, называют лизогенной. Так вот, думали, что какой-то фаг переносит из агробактерий в клетки растений бактериальные гены, вызывающие индукцию галлов. С тех пор как феномен лизогении был обнаружен у A. tumefaciens, многим хотелось установить связь между фагоносительством бактерий и их патогенностью. В экстрактах тканей корончатых галлов обнаруживали фаговые частицы. Появились сообщения о том, что фаги и вправду могут быть вовлечены в индукцию опухолей. А в одной из научных статей говорилось, что опухоли можно индуцировать даже не самими фагами, а просто выделенной из них ДНК. Куда уж убедительнее - генетическая информация об опухоле-образовании заложена в фаговой ДНК! Азарт да еще успех первого эксперимента часто уводят ученого в поисках истины на боковые тропки, на которых так легко заплутаться. Недаром образчиком "черного юмора" у экспериментаторов служит фраза "успех в первом опыте - подарок дьявола".
Это в полной мере проявилось в истории поисков сущности TIP. Все больше накапливалось фактов, отрезвляюще действующих на сторонников фаговой теории развития бактериального рака. Во-первых, не удалось индуцировать опухоли с помощью внесения в растения очищенных фаговых частиц. А во-вторых, штаммы агробактерий, излеченные от фага, не утрачивали своей патогенности. Поэтому "на должность" TIP стали примерять саму бактериальную ДНК, мол, раз с фагом не выходит, обойдемся без посредников. Но и тут ученых ждало разочарование - достоверно индуцировать опухоли с помощью изолированной ДНК из агробактерий, то есть провести прямую трансформацию растительных клеток с помощью бактериальной ДНК не удалось.
Интерес к проблеме TIP, а заодно и корончатых галлов чуть было не начал гаснуть, когда в 1974 году группа исследователей из Гентского университета, возглавляемая Джозефом Шеллом и Марком ван Монтегю (их имена еще не раз встретятся на страницах этой книги), опубликовали работу, в которой сообщили о своем открытии: патогенные штаммы A. tumefaciens четко отличаются от непатогенных одним признаком - первые содержат крупную плазмиду, состоящую из 150 - 200 тысяч пар нуклеотидов, вторые лишены такой плазмиды. Было сделано и другое важное наблюдение. Известно, что у агробактерий, как и у других почвенных микроорганизмов, температурный оптимум приходится на 26 - 28°С. Если выращивать бактерии при более высокой температуре, скажем при 36°С, они хотя и вырастут, но опухолеродную способность потеряют. Выявилось, что причина этого - потеря плазмиды, не выдерживающей такой "сауны" и убегающей из клетки. Шелл и ван Монтегю хорошо поняли значение работы, написав в своей замечательной статье следующее: "Тумор-индуцирующий принцип, открытый Брауном в 1947 г., находится у образующих корончатые галлы штаммов агробактерий на крупных плазмидах".
Значит, плазмида? Что ж, это открывает неплохие возможности для дальнейшего проникновения в тайну бактериального рака растений. К тому же хотя и крупна ДНК этой плазмиды - может поместиться сотня-другая генов, - однако все-таки примерно в 25 раз меньше, чем генов в хромосоме, а следовательно, и разобраться будет легче.
Так, в фокусе дальнейшего изучения коронча-тогалловой болезни оказалась плазмида, названная Ti, то есть опухолеродная (по-английски tumor inducing). Ti стали всесторонне исследовать во многих лабораториях. Особенно много удалось сделать, помимо групп Шелла и ван Монтегю, американцам Эугену Нестеру, Мэри-Делл Чилтон, Милтону Гордону и их сотрудникам в Вашингтонском университете в Сиэтле, Роберту Шилперурту и его коллегам в Лейденском университете в Голландии. Одна за другой выходили работы, приводившие новые неопровержимые свидетельства причинной связи между носительством pTi (напомним, что маленькое латинское "p" вначале означает, что речь идет о плазмиде) и способностью бактерий индуцировать опухоль, определять синтез в ней опина и использовать этот опин для своего питания. Все три свойства бактерии утрачивают, если из них изгнать всю или часть плазмиды либо вызвать в плазмиде мутационные изменения, и восстанавливают, если вновь перенести Ti в излеченные от нее клетки. Такой процесс осуществляют с помощью уже известного нам процесса конъюгации: бесплазмидные бактерии-реципиенты смешивают с плазмидосодержащими донорами. Часть клеток в смеси вступает в скрещивание. Ну а результат известен - возникает потомство. Получивший Ti реципиент автоматически становится грозой для растений. Между прочим, в ходе таких опытов было выяснено еще одно свойство некоторых опинов, в особенности октопина. Оказалось, что если октопин присутствует в смеси скрещивающихся бактерий, то он стимулирует перенос pTi от тех клеток, что имеют плазмиду, в те, что лишены ее. Правда, бактерии-доноры pTi в результате такого "пожертвования" ничего не теряют, ведь от них в реципиенты переносится лишь копия плазмидной ДНК, а значит, теперь плазмида будет не только у доноров, но и у их партнеров по скрещиванию. В такой щедрости бактерий заложен немалый для них смысл: чем больше бактерий в популяции окажется с плазмидами, тем больше будет возможностей для образования опухолей на растениях, тем больше будет продуцентов "вкусных и питательных" опинов.
Об этом интереснейшем феномене взаимодействия между бактерией и её жертвой - растением еще пойдет разговор, а пока уточним, что же следовало из описанных опытов. Во-первых, стало очевидно, что по крайней мере два процесса, протекающих в растительных клетках, инфицированных A. tumefaciens, а именно опухолевая трансформация и синтез опинов в трансформированных клетках происходят при участии генов, расположенных в pTi. Во-вторых, способность специфично обеспечивать синтез определенного опина в опухолевой растительной клетке, а самой его же усваивать в качестве питательного вещества, кодируется плазмидой. Раз так, то pTi можно различать по тому, за какой опин они отвечают и какой "едят" их хозяева - бактерии. По этому признаку pTi, как и агробактерии, были разделены на типы - октопиновые, нополиновые, агропиновые и другие.
Открытие Ti-плазмид, их изучение выявили факт фундаментального значения. Состоит он в том, что гены прокариот-бактерий могут контролировать некоторые признаки эукариотических организмов, в данном случае растений. Опухолевое перерождение растительных клеток - процесс стойкий, наследующийся в потомстве. В культивируемых вне организма опухолевых клетках их характерное свойство передается из поколения в поколение в течение наблюдений, длящихся теперь уже свыше 20 лет. Означать все это могло лишь одно - в природе имеется механизм, обеспечивающий перенос плазмидных генов от бактерий к растениям и их последующее существование и проявление в новом хозяине. Чтобы доказать, что дело обстоит именно так, нужно было, во-первых, выявить в Ti-плазмидах гены, ответственные за возникновение опухолей и синтез в них опинов; во-вторых, и это, пожалуй, самое важное, обнаружить присутствие этих генов в трансформированных растительных клетках.
В решении обеих этих задач помогли "прыгающие" участки ДНК - транспозоны, с которыми мы уже познакомились в предыдущей главе. Сравнивая свойства исходных pTi и их производных со вставками различных транспозонов, удалось выявить многие функции pTi, определить и локализовать их гены на картах плазмидной ДНК. Особенно помогло в этом сочетание двух методов - транспозонного мутагенеза и рестрикционного анализа.
Предположим, например, что вставка транспозона в Ti-плазмиду привела бактерии к утрате способности использовать как источник питания нопалин. Вероятно, что вставка произошла в гене, кодирующем фермент, разлагающий опин. Где же на карте Ti-плазмиды, то есть в молекуле ее ДНК может лежать этот ген?
Ответить на вопрос помогут рестриктазы. Мутантную и нормальную ДНК обрабатывают какой-либо рестриктазой, а размеры полученных ферментов сравнивают, разгоняя их в электрическом поле в геле из агарозы. Оказывается, наборы фрагментов у мутантной и нормальной плазмид неодинаковы. У мутанта исчез один фрагмент, обозначим его x, зато появились два новых. Их суммарная длина равна длине фрагмента x и транспозона. Это значит, что транспозон встроился внутрь фрагмента x и, следовательно, именно в нем расположен ген усвоения нопалина. Проводя дальнейший анализ, основанный на сочетании нескольких рестриктаз и молекулярного клонирования полученных фрагментов, можно точно установить локализацию гена. Вот почему транспозонный мутагенез стал очень эффективным методом генетического анализу Ti-плазмид. Благодаря ему кольцевую ДНК Ti-плазмид удалось как бы разделить на четыре района. Два из них встречаются не только у Ti, но и у других плазмид. В одном находятся гены, обеспечивающие способность плазмид размножаться в бактерии-хозяине. В другом - гены, кодирующие конъюгативность плазмид, то есть их способность переноситься из бактерии в бактерию. А вот два других района свойственны только Ti. Один из них получил название района Vir (от слова вирулентность). Другой назван Т-районом (от английского transferred - перенесенный). В 1977 году М.-Д. Чилтон с сотрудниками первой доказала, что в ДНК клеток корончатогалловых опухолей включен определенный участок Ti-плазмиды, а немного позднее эта же исследовательница представила убедительные данные, что Т-район встраивается не куда-нибудь, а именно в ядерную ДНК растительной клетки, что ведет к ее перерождению в опухолевую. Как только Т-район оказывается в геноме растения, он получает новое имя - Т-ДНК. Это позволяет ученым различать без специальных оговорок, о чем идет речь в каждом данном случае: если пишут или говорят Т-район - значит, о бактериях, если Т-ДНК - о трансформированных растительных клетках.
О том, какие функции заложены в Т-районе и почему его встройка в растительную ДНК ведет к образованию опухоли, мы расскажем чуть позже. А пока попробуем разобраться в механизме внедрения Т-ДНК в геном растения.
Одна из привлекательных гипотез состояла в том, что Т-район имеет транспозоноподобную структуру и подобно другим "прыгающим" генам способен перескакивать из плазмиды, проникшей из бактерии в растение, в ядерную ДНК. В пользу этой гипотезы говорили данные по секвенированию последовательностей, окружающих с двух сторон, или, как еще принято говорить, фланкирующих (то есть стоящих на флангах) Т-район в плазмидах Ti, и их сравнению с последовательностями, стоящими, как часовые, с обеих сторон Т-ДНК в ядрах клеток корончатых галлов.
Оказалось, что во всех случаях, а изучены были опухоли на самых разных растениях, индуцированных Ti-плазмидами различных типов, Т-ДНК окружены повторами из 25 пар нуклеотидов. Это прямые повторы - стоящий слева от Т-ДНК повтор имеет такой же порядок расположения пар нуклеотидов, что и стоящий справа от нее. В общем Т-район и Т-ДНК имеют действительно некоторое сходство с транспозонами. Однако есть и различия. Как правило, для того чтобы "прыгать", обычным транспозонам нужны "обе ноги", оба фланкирующих их повтора. Для Т-района ситуация другая: оказалось, что повтор, стоящий справа от него, намного важнее, чем тот, что стоит слева. Это навело на мысль, что, когда Т-район входит в растительную клетку, правый повтор служит как бы "лоцманом", бережно проводящим стоящий за ним Т-район через всевозможные "рифы", оказывающиеся на его пути, в ядро нового хозяина. Нечто похожее можно наблюдать и при обычных переносах плазмид между бактериями - переносящая плазмида часто оказывается защищенной специальной концевой молекулой от разрушения под действием ферментов клетки реципиента, набрасывающихся на входящую ДНК, как на "чужую". Что ж, ферменты в данном случае делают благое дело с точки зрения данной клетки - они сохраняют в неприкосновенности ее геном от "чужака". Но вернемся к Т-району и окружающим его повторам из 25 пар нуклеотидов и посмотрим, что обеспечивает центральное событие опухолевой трансформации растительной клетки - появление Т-ДНК в хромосоме растения?
Ответить на этот вопрос удалось буквально в последние 1 - 2 года. Оказалось, что перенос Т-ДНК зависит от работы бактериальных генов, расположенных в хромосоме. По крайней мере два из них обеспечивают присоединение агробактерий к клетке растения. Но этого мало. Видно, очень нужно бактериям протолкнуть своего "лазутчика" в растение, если не поскупились они собрать в Ti-плазмидах "грозную силу" - целых семь локусов (локус - место в ДНК, занимаемое генами; иногда в одном локусе находится несколько генов, отвечающих за общее дело), у которых одна цель: обеспечить процесс переноса Т-ДНК. Локусы эти и образуют Vir-район длиной в 35 тысяч пар нуклеотидов, что составляет примерно шестую часть всей плазмиды Ti. Их обозначают латинскими буквами от А до F. Если повредить локусы A, B, D, и G, опухоль образоваться не сможет, если C, E и F - сможет, но лишь на немногих видах.
Рис. 17
Когда бактерии находятся в почве в свободно живущем состоянии, Vir-локусы как бы дремлют, с них не списывается мРНК, а значит, и не синтезируются белки. Встреча с пораженным двудольным растением пробуждает гены. "Будильником" служит само растение, вернее, небольшие молекулы, синтезирующиеся в ране. Они представляют собой фенольные соединения. Одно из них, названное ацетосирингоном, даже стало производиться в качестве препарата. Для чего, расскажем позже. А сейчас посмотрим, каким образом находящийся в раневом соке ацетосирингон может разбудить гены vir. Хотя все детали картины пока не выяснены, оказалось, что эти гены, можно сказать, только и ждут от растения сигнала: "просыпайтесь". Сигнальные молекулы проходят внутрь бактериальной клетки. Помогает им в этом белок - продукт гена vir A. Его называют порином, поскольку его задача - формировать поры в стенке бактериальной клетки. Если повредить ген vir A мутацией, например вставкой транспозона, возможность проникновения ацетосирингона в клетку резко уменьшается.
Интересно, что ген vir A бодрствует постоянно. Он как бы стоит на вахте в ожидании сигнала от растений. Поэтому белок - продукт этого гена всегда наготове. Проникнув внутрь бактериальной клетки, растительная сигнальная молекула "пробуждает" другой ген - vir G. Под его контролем начинает синтезироваться белок, являющийся активатором остальных локусов vir. Думают, что этот белок под действием фенольных соединений типа ацетосирингона изменяет свою форму, что помогает ему взаимодействовать с регуляторными участками других генов vir. В итоге эти гены начинают активно работать, с тем чтобы обеспечить перенос Т-района Ti-плазмиды в геном растения. Оказалось, что, прежде чем попасть в растительную клетку, Т-район должен претерпеть ряд превращений. Вначале в определенных участках, расположенных с обеих сторон Т-района в окружающих его концевых повторах (назовем тот, что справа, - А, а тот, что слева,- В), должны произойти надрезы в одной из нитей плазмидной ДНК. Это делает фермент, кодируемый локусом vir D. Образование надрезов способствует синтезу в клетках однонитевой копии Т-района, которую так и называют Т-нитью, при этом надрезы в повторах А и В по краям Т-района как бы указывают, где синтезу начинаться и где заканчиваться. В результате всех этих событий в клетках бактерий Т-район отделяется от плазмиды Ti и замыкается в кольцо. "Застежкой" служат концевые повторы, слипающиеся между собой. Далее такие "мини"-плазмиды получают возможность пройти в растительную клетку и внедриться в ядерную ДНК.
Как это происходит, в деталях пока не ясно, однако есть основания предполагать, что механизм переноса Т-района близок к механизму переноса полового фактора - плазмиды F при скрещиваниях у E. coli, а он изучен неплохо. В этом случае имеет место полярный, то есть однонаправленный (от донора к реципиенту) перенос одной из двух нитей кольцевой плазмидной ДНК. Вначале ДНК F-фактора разрезается ферментом нуклеазой в особом локусе ori T, являющемся точкой начала (по-английски origin) переноса (transfer). У плазмиды F есть и специальные гены, кодирующие такой фермент, подобно тому, как у Ti-плазмиды есть локус vir D, состоящий из двух генов. Затем, ведомая частью ori T, как "лоцманом" (не правда ли, похоже на ситуацию с правым концевым повтором Т-района, первым входящим в растительную клетку?) нить F-фактора переносится с помощью особых половых ворсинок в реципиентную клетку. И здесь, по-видимому, имеется аналогия с переносом Ti-плазмиды: белки - продукты генов vir В, "разбуженные" ацетосирингоном, накапливаются в бактериальной мембране, образуя, возможно, на поверхности клетки структуры, похожие на половые ворсинки у кишечной палочки. Эти структуры могут в принципе обеспечить перенос Т-нити в растительную клетку.
Интересно, что гены vir заботятся не только о том, чтобы Т-район мог вырезаться из Ti-плазмиды и покинуть бактерию, но и его дальнейшей судьбе в растительной клетке. Похоже, что именно этим заняты гены, находящиеся в локусе vir E. Белки, которые они кодируют, выходят из бактерий и действуют на растительную клетку, способствуя включению Т-ДНК в растительный геном. Словом, Vir-район отвечает за все этапы, связанные с переносом ДНК из бактерий в растения. В следующей главе мы узнаем, как эту природную функцию генов vir ученые стали использовать в генной инженерии.
Детальное изучение взаимодействия бактерий с пораженным растением складывается из нескольких этапов. Сначала бактерии как бы пробуют растение на вкус, связываются с ним непрочно. Примерно час нужен бактериям "на раздумье". Но когда "решение принято", они начинают активно синтезировать целлюлозу, играющую роль связывающего жгута, и уже через два часа связь между бактериями и клетками растений в зоне раны становится необратимой. Проходит еще часа четыре, и начинается перенос плазмиды Ti из бактерий в клетки растений. Заканчивается он через восемь часов от момента попадания бактерии на поверхность растения. Теперь присутствие бактерий становится необязательным для дальнейшего развития опухолей. Как говорится, "мавр сделал свое дело, мавр может уходить".
Одновременно с изучением механизмов проникновения Т-ДНК в растения в различных лабораториях мира стремились понять, в чем сущность онкогенной активности Т-ДНК, почему ее включение в растительное ядро ведет к опухолевой трансформации клетки. Т-ДНК сравнительно невелика. Ее размер варьирует в зависимости от того, к какому типу относится плазмида Ti, вызвавшая опухоли. Было обнаружено, что в Ti-плазмидах октрпинового типа Т-район разделен на два прилегающих друг к другу сегмента ДНК. Тот, что находится ближе к Vir-району, обозначен как левый. Он состоит из 13 тысяч пар нуклеотидов. Правый сегмент почти наполовину короче. Эти сегменты могут переноситься в геном растения либо порознь, либо в виде одной непрерывной структуры. Однако, для того чтобы опухоль образовалась, важно, чтобы в растении оказался левый сегмент. У плазмид нопалинового типа Т-район непрерывная структура из 23 тысяч пар нуклеотидов, и вся она передается в растения. Несмотря на различия между Т-районами Ti-плазмид этих типов, у них есть и общий участок длиной всего в 9 тысяч пар нуклеотидов. Это навело на мысль, что именно в пределах "общего" участка и находятся онкогены - гены, чья работа определяет превращение нормальной растительной клетки в раковую. Что же собой представляют эти плазмидные онкогены? Какова их роль в образовании корончатых галлов? Ответить на эти вопросы удалось не сразу. Потребовалось еще раз вдумчиво проанализировать все, что было известно о корончатых галлах и свойствах агробактерий, чтобы предположить, что гены, входящие в состав Т-ДНК, вовлечены в синтез гормонов растений (фитогормонов) - ауксинов и цитокининов.
Термин "гормон", введенный в научный оборот еще в начале века английским физиологом Эрнстом Старлингером, происходит от греческого "хормос" - приводить в движение, побуждать к действию, он применялся поначалу к млекопитающим, затем к насекомым. У человека и животных были открыты десятки веществ - регуляторов роста, развития, полового созревания, различных обменных процессов, вырабатываемых специальными органами внутренней секреции. Изучение гормонов стало главной задачей особого раздела физиологии и медицины, называемого наукой о внутренней секреции - эндокринологией. Имеются ли подобные регуляторы у растений? Об этом думал еще Чарлз Дарвин. Великий создатель эволюционной теории в последние годы своей жизни стремился обнаружить сходство в процессах жизнедеятельности у животных и растений, что позволило бы доказать общность их происхождения. В своей книге "Способность к движению у растений", опубликованной в 1880 году, Дарвин экспериментально доказал, что на верхушках осевых органов растений имеются чувствительные зоны, воспринимающие внешние сигналы, например свет, и передающие полученные раздражения в нижележащие зоны, возможно, с помощью химических стимулов. Ответом на их действия, по мысли Дарвина, является ростовая реакция растений. Он провел аналогию между функцией верхушек у растений и мозга у животных. Догадка Дарвина о возможности химической передачи раздражения у растений осталась незамеченной, и в этом отношении замечательной идее Дарвина повезло не больше, чем закономерностям наследования, обнаруженным Менделем. Однако позже в работах немецкого ботаника Юлиуса Сакса, американского физиолога растений Фритса Вента, датчанина Петера Бойсен-Йенсена, советских ученых Н. Г. Холодного