Глава 3. Растения из колбы

Наш мир только что отыскал еще один мир... не меньший размерами, не менее плодородный, чем наш, и настолько свежий и в таком нежном возрасте, что его еще обучают азбуке.

Монтень

Создание трансгенного организма, в котором перенесенный в составе рекомбинантной ДНК ген обусловливает новый признак и передает его потомству, - вот цель любой генно-инженерной работы. Но чтобы ввести в растительную клетку нужный ген, необходимо суметь отделить ее от целого растения и научить жить и давать потомство в отрыве от "старого коллектива". Это значит, что успех будет зависеть от того, есть ли в руках ученых методы культивирования клеток и тканей различных растений in vitro, способы введения рекомбинантной ДНК в эти клетки или ткани и возможность вырастить из них плодовитые растения. Иными словами, генный инженер должен владеть суммой приемов и методов, объединяемых теперь общим названием "клеточная инженерия растений".

Само сочетание этих слов, вполне теперь привычное, вышедшее из лабораторий и институтов на страницы газет и журналов, в передачи по радио и телевидению, ставшее темой не одной уже научно-популярной книги, еще какой-нибудь десяток лет назад вовсе не существовало. Если вдуматься, это довольно странное обстоятельство, поскольку уж во всяком случае в сельское хозяйство биотехнология, если под ней понимать связь мастерства, умения со знаниями о живом, пришла намного раньше, чем в другие виды человеческой деятельности. Конечно, уровень этой биотехнологии соответствовал уровню знаний наших предков о законах жизнедеятельности различных окружавших их живых организмов, в том числе и растений, и тем не менее он оказался достаточным, чтобы вначале одомашнить животных, дикие растения, а затем и вести с ними вначале во многом эмпирически, интуитивно и на глазок селекционную работу. Ясно также и то, что развитие методов широкомасштабного культивирования клеток и тканей растений на искусственных средах и создание способов их регенерации в зрелые растения подняли биотехнологию в растениеводстве на качественно более высокий уровень. Истоки этой новой биотехнологии следует искать в 30-х годах нашего века. Еще в 1937 году французский ученый Р. Готре с успехом культивировал in vitro кусочки ткани моркови. При выращивании в среде, обогащенной ауксином, растительная ткань быстро разрасталась, образуя каллус (помните, бесформенное скопление недифференцированных клеток, напоминающие по виду морскую губку). Такие же каллусы ложатся "заплатками" на раневые поверхности растений. Эту разросшуюся ткань можно разделить на части и пересадить на новую твердую или жидкую питательную среду, где каждая часть будет разрастаться дальше. Некоторые линии тканевых культур, полученные Готре, продолжают поддерживаться в лабораториях до сих пор. В начале 50-х годов научились получать культуры не только тканей, но и отдельных клеток растений. Их стали выращивать в виде жидких суспензий, подобно тому, как выращивают обычно бактериальные культуры.

Ученые убедились, что тканевые и клеточные культуры сохраняют основные признаки исходного растения. Поэтому культуры стали использовать для получения вторичных метаболитов. Так называют соединения, являющиеся как бы побочным продуктом жизнедеятельности микробных, животных и растительных клеток. Многие из них обладают ценными для человека свойствами. Культивирование клеток и тканей различных растений в промышленных масштабах позволяет получать ценнейшие вещества, используемые в сельском хозяйстве, фармацевтической и химической промышленности. Так, из растения под названием "воробейник аптечный" получают шиконин - эффективный препарат при лечении ожогов и некоторых кожных заболеваний. Из табака - убихинон-10, помогающий при болезни сердца (надеюсь, что это сообщение не воодушевит любителей курения), из винограда - краситель антоцианин и т. д. Активными продуцентами вторичных метаболитов служат и клетки "волосатого" корня, образующегося на растениях, зараженных ризогенными агробактериями. Однако подробнее об этом будет рассказано в главе "Фантастика и реальность". Советскими и японскими учеными были разработаны способы промышленного выращивания клеточных культур продуктивных сортов женьшеня - реликтового растения, встречающегося лишь в отдельных районах на Дальнем Востоке. Теперь "корень жизни" не нужно отыскивать в таежной глуши: на заводах получают высокий урожай биомассы, содержащей физиологически активные вещества, снижающие усталость и повышающие сопротивляемость человеческого организма. Недаром родовое название - Рапах - дали женьшеню по имени древнегреческой богини Панакии - всеисцеляющей. Промышленное выращивание культуры лекарственных растений оказалось рентабельным. Если выращиваемые клетки подвергнуть мутагенезу и специальному отбору, то на основе полученных мутантов можно создать особенно ценные линии. Таким способом у нас в стране были получены клеточные линии раувольфии змеиной, 10-кратно превосходящие исходный штамм по уровню ценного для медицины антиаритмического соединения аймалина.

Каллусная ткань подобна глине в руках горшечника. Из нее можно "слепить" отдельные органы растений - корни, побеги, листья. Этот процесс называют рождением органов - органогенезом. Дело в том, что нормальная соматическая растительная клетка может дать начало любой части растения. Это ее уникальное свойство называют тотипотентностью. На нем основана способность растения к восстановлению (регенерации). Ученые научились проводить весь цикл работ, необходимых для того, чтобы изолированная и выращиваемая in vitro клетка сформировала ткань, а из нее образовалось целое растение. Метод получения растений из каллусной ткани называют кали-клонированием. По существу, это вегетативное размножение растений. Очень часто его проводят с помощью апикальной меристемы - ткани, образованной скоплением клеток, расположенных в верхней части стебля. Она обладает удивительным свойством - оставаться "островком здоровья", даже если вся остальная часть растения заражена вирусами. Меристемная ткань несет зародышевые клетки. При культивировании меристемы в стерильных условиях на твердой питательной среде ее клетки размножаются и образуют каллус. Обработка фитогормонами (ауксином, цитокинином и гиббереллиновой кислотой) приводит к тому, что из недифференцированных каллусов отрастают побеги, из которых удается вырастить здоровые растения. Сейчас с помощью этой технологии получают свободные от вирусов клубни картофеля, семена и рассаду клубники, малины, земляники, цветочно-декоративных культур.

Метод меристемного размножения используется и для искусственного выращивания таких гигантов растительного мира, как масличная пальма. Во многих влажных тропических районах Африки, Америки и Юго-Восточной Азии она - основной источник получения пищевых жиров. В мировом масштабе ее плантации занимают несколько миллионов гектаров, а производство масла еще к началу 80-х годов достигло 5 миллионов тонн. Пальма как масличная культура уступает лишь сое, масла которой производят более 13 миллионов тонн в год. Масличная пальма живет 100 лет и более, но получать ее плоды в промышленных масштабах удается лишь в первые 25 - 30 лет. Значит, каждые 30 лет плантацию нужно полностью менять. Есть и еще одна трудность - масличная пальма не образует побегов и боковых ростков, а следовательно, получить новое растеньице обычным вегетативным размножением нельзя. Ученые решили обратиться к технике кали-клонирования. В африканском государстве Кот-д'Ивуар была создана научно-исследовательская станция, на которой из каллусной ткани получают эмбриоиды, а из них за 3 месяца - побег длиной 12 сантиметров. С помощью обычной техники для этого потребовалось бы несколько лет.

При многократном пересаживании кусочков каллусной ткани в культивируемых клетках довольно часто возникают вариации. Растения, выращенные из измененных клеток и тканей, дают семена, позволяющие получить потомство с устойчивым новым признаком - сомаклоны, или спорты. Эта методика называется сомаклональной селекцией. В ее основе лежит явление сомаклональной изменчивости, то есть возникновение генетических изменений не в половых клетках (гаметах), и в клетках тела (сомы) растения. Это может быть нарушение числа хромосом в клеточном ядре, мутации в определенных ядерных генах или генах органелл - хлоропластов и митохондрий. Среди подобных сомаклонов удается выбрать варианты, сохранившие все положительные характеристики исходного сорта и приобретшие новые ценные свойства. Столь сложные сочетания старого и нового традиционными приемами селекции - гибридизацией и мутагенезом - получить очень трудно.

Большой вклад в изучение физиологии растений и совершенствование методов культивирования их клеток и тканей внесли работы члена-корреспондента АН СССР Раисы Георгиевны Бутенко и созданной ею школы, из которой вышли видные специалисты по физиологии и клеточной инженерии растений. От сомаклонов картофеля в отделе Института физиологии растений АН СССР, руководимом Р. Г. Бутенко, получены формы, отличающиеся одновременно и высокой продуктивностью, и устойчивостью к вирусам и фитофторе. Сомаклональные формы риса сочетают в себе скороспелость с удлиненной формой зерновки. От спортов произошли новые сорта грейпфрутов, апельсинов и некоторых других видов растений.

Дальнейшим шагом вперед в технике культивирования растительных клеток стало получение искусственных семян. Они очень нужны в тех далеко не редких случаях, когда выведенные селекционерами урожайные и устойчивые к внешним воздействиям сорта не дают семян либо дают слишком мало. Искусственные семена люцерны, пшеницы, риса, моркови получают теперь прямо в огромных чанах - ферментерах. Для этого их наполняют питательной средой, стимулирующей превращение клеток в зародышевые. Собственно, почему бы и нет? Ведь растительные клетки, как мы знаем, тотипотентны, а это значит, что они могут превращаться не только в вегетативные, но и в зародышевые. Попав в такой чан, клетки начинают бурно размножаться. При этом часть из них образует нечто вроде зародышей (эмбрионов). Они формируют семядоли, корешок и центральную почку. Чтобы не путать такие искусственные образования с настоящими эмбрионами, их называют эмбриоидами. Эмбриоиды нужно еще одеть в оболочку, для чего их помещают в специальную клейкую смесь питательных веществ. Если такие суррогатные семена высадить в землю, они прорастут и дадут нормальные растения.

Эта очень ценная новая технология позволяет размножать сельскохозяйственные культуры без опасения, что они могут, как это часто бывает при обычном половом скрещивании, потерять новые признаки. Взяв у однажды созданного гибрида либо трансгенного растения кусочек ткани, можно быть уверенным - его клетки смогут стать прародителями всех будущих растений, которые можно будет размножать практически бесконечно. Это особенно важно при работе с гибридами пшеницы, ячменя, риса, бобовых и ряда других культур. Есть еще одно обстоятельство: пройдя тепловую обработку в ферментере, растительные ткани полностью освобождаются от вирусной инфекции, а значит, будущие семена также будут здоровыми. Искусственные семена можно начинить минимальными дозами различных пестицидов, чтобы защитить проростки от насекомых и сорняков, а под оболочку поместить азотфиксирующие микроорганизмы, и тогда растениям, возможно, удастся хотя бы частично обойтись без азотных удобрений. Искусственные семена и эмбриоиды могут стать мишенями для введения новых генов в составе гибридных ДНК, сконструированных in vitro. Словом, получение таких семян сулит очень многое уже в недалеком будущем.

Селекционеры издавна стремились объединить в одно целое лучшие признаки не похожих друг на друга растений. Для этого нужно было перехитрить природу, обойти ограничения обычного полового размножения - смести барьеры, изолирующие виды живых организмов один от другого. Попытки отдаленной гибридизации уходят корнями в XVIII век, когда были созданы первые "растительные мулы" - неспособные к образованию потомства искусственные растительные гибриды. Особенно много работал с такими гибридами выдающийся немецкий ботаник и селекционер Иозеф Готлиб Кельрейтер. И все же максимум, что тогда удалось сделать,- это получить бесплодные межвидовые гибриды, или бастарды, как было принято их называть. Лишь в 20-х годах уже нашего века появился генетик, первым отважившийся совместить до сих пор несовместимое. Им стал один из ближайших сотрудников Н. И. Вавилова Георгий Дмитриевич Карпеченко. Цель его деятельности - получение гибридов путем скрещивания растений, относящихся не просто к разным видам, но к разным родам. Скрестив редьку и капусту, то есть представителей двух родов одного семейства, ученый получил первый межродовой гибрид.

Вначале, однако, все было, как и раньше, - семян гибрид не давал. Почему? Дело в том, что и редька, и капуста, как и положено высшим растениям, - диплоиды: каждая их соматическая клетка содержит двойной набор хромосом. В половые клетки попадает половинное число хромосом. При слиянии двух половых клеток в одну - зиготу - в ней восстанавливается исходное двойное число хромосом. Если зигота образована половыми клетками одного вида, парным хромосомам легко найти друг друга и соединиться в новом наборе. У клеток разных видов хромосомы отличаются, и найти пару очень трудно. Чем дальше друг от друга разошлись виды, тем меньше общего между их хромосомами, а значит, тем труднее им объединиться. Эти различия на уровне хромосом служат в руках природы важнейшим рычагом, препятствующим формированию потомства при скрещивании разных видов, а тем более родов растений. Как преодолеть этот барьер? Как сделать, чтобы при отдаленной гибридизации получались не бесплодные "мулы", а нормальные растения? Г. Д. Карпеченко сумел найти ответ на этот мучивший многие поколения ученых вопрос. Он понял причины бесплодия гибридов: чтобы его устранить, нужно дать каждой хромосоме шанс найти себе пару. Для этого следует искусственно, например с помощью хорошо известного генетикам колхицина, удвоить набор хромосом у каждого из гибридов, получившихся в первом поколении. Тогда они смогут дать потомство. Подтверждением правильности теории стали 19 первых в мире плодовитых капустно-редечных гибридов. В следующем поколении ученые уже имели дело с тремя сотнями невиданных ранее "монстров". Ни кочана, ни корнеплодов они не образовывали и, следовательно, хозяйственного значения не имели, зато их научная ценность была очень велика.

Г. Д. Карпеченко, как и его учитель Н. И. Вавилов, был непримиримым борцом за научную генетику и селекцию, это определило стойкость и последовательность его позиции в генетических дискуссиях 30-х годов, развернутых Т. Лысенко с целью захватить командные высоты в отечественной биологии. Вот почему Г. Д. Карпеченко не сумел закончить свои блестящие опыты - он стал жертвой "лысенковщины" и погиб в сталинских застенках.

Поступательное движение науки между тем еще не удалось остановить никому. Идеи Г. Д. Карпеченко легли в основу работ видного советского селекционера А. Ф. Шулындина, создавшего новые формы тритикале путем гибридизации озимых твердых пшениц с рожью с последующим удвоением у гибридов числа хромосом. Тритикале - первый созданный человеком новый вид культурного растения. Начало его создания датируется еще 1888 годом, когда немецкий селекционер Вильгельм Рымпау сумел создать плодовитый гибрид мягкой пшеницы и ржи. Век кропотливой и напряженной работы понадобился ученым, чтобы довести эту работу до сортов, высеваемых на зерно и зеленый корм и у нас в стране, и на больших площадях в ПНР, Австралии, Канаде и других странах.

В наше время открылась принципиально новая возможность проводить отдаленную гибридизацию высших растений, получать их "химерные" формы. Ткани растений научились обрабатывать ферментами, расчленяющими их на отдельные клетки, окруженные жесткой полисахаридной оболочкой, и растворяющими эту оболочку. Если протопласты культивировать в определенных условиях, они могут снова "одеться", восстановить клеточную стенку. Теперь бывшие протопласты никак не отличить от обычных клеток, культивируемых in vitro. Они также способны делиться, образовывать колонии, ткани и затем даже целые растения. Но это через какое-то время, а пока клетки "раздеты", их можно заставить поглотить из окружающей среды такие крупные молекулы, как белки и нуклеиновые кислоты, либо даже частицы, например изолированные клеточные органеллы. Можно также вынудить протопласты слиться между собой, а из них уже получить "химерные" гибридные растения. Эта техника открыла невиданную ранее возможность провести отдаленную гибридизацию высших растений. Первым о создании межвидового гибрида путем слияния протопластов сообщил в 1978 году профессор Георг Мельхерс, работавший в Институте имени Макса Планка в ФРГ. Он получил гибрид картофеля и томата, названный поматом. Поматы приобрели сенсационную известность. Оказалось возможным в один ход перенести в картофель, поддающийся генетическому улучшению с большим трудом, целый комплекс признаков устойчивости к болезням, скомбинированный в сорте томата, использованном для получения гибрида. С тех пор появилось свыше сотни работ по так называемой парасексуальной, то есть в обход полового скрещивания, или, как ее еще называют, соматической (потому что участвуют не половые клетки, а клетки сомы) гибридизации высших растений. Вслед за поматом были созданы многие межродовые гибриды, полученные методом слияния и последующей регенерации протопластов. Среди них гибриды моркови и петрушки, красавки и табака, апельсина и лимона. Методика гибридизации отработана лучше всего для представителей семейства пасленовых, в которые входят табак, картофель, томаты, дурман, белладонна, петуния и некоторые другие виды. Соматические гибриды получены также у растений из семейства крестоцветных и зонтичных. Всего межвидовые скрещивания по методу слияния протопластов проведены между представителями 74 видов растений.

Словом, техника слияния протопластов открыла новую веху в истории отдаленной гибридизации. После работы Г. Мельхерса, несмотря на то что бесплодный помат, в сущности, можно отнести к "лабораторным курьезам", стали говорить о начале второй "зеленой революции". Действительно, за сравнительно короткий срок на основе межвидовых гибридов удалось получить новые сорта капусты кочанной, моркови, баклажанов, картофеля, табака, стручкового перца. Конечно, это успех. Однако нельзя забывать, что, во-первых, удается, как правило, получать полноценные соматические гибриды только при слиянии клеток сравнительно очень близких видов, а во-вторых, не только картофель и тем более не табак кормят человечество. Ясно, что гораздо большее значение имела бы возможность получать на основе слияния протопластов новые сорта важнейших для человека культур - риса, пшеницы, сои, но для этого ученым необходимо научиться получать протопласты из клеток этих растений и суметь заставить их регенерировать.

Японские исследователи из компании "Мицубиси кемикл", работающие с важнейшей для страны культурой - рисом, преуспели в решении обеих этих проблем. В 1985 году они сообщили о своей удаче. На основе каллусной культуры риса удалось получить протопласты и регенерировать их в целые клетки. Вначале они организовались в недифференцированную ткань, а уже через месяц культивирования стали образовываться побеги и корни. Эти побеги некоторое время выращивали в пробирках, а затем пересаживали в горшки с землей. После подращивания в горшках растеньица высаживали в поле. Японским ученым удалось получать протопласты из клеток пшеницы, тритикале, кукурузы и других злаков. Однако регенерировать их удается в лучшем случае до стадии каллусной ткани, очень редко до проростков, но не до целых растений.

Соматическая гибридизация между нескрещивающимися в природе родительскими формами открыла новый путь для конструирования растений. Появилась возможность манипулировать изолированными растительными клетками. Так возникла клеточная инженерия - интегральная часть современной биотехнологии растений. Слиянием протопластов можно получать самые различные комбинации родительских генов у гибридов. Уже теперь удается конструировать формы, у которых ядро происходит от одного из родителей, а цитоплазма - от другого. Созданы, например, гибриды культурного и дикорастущего картофеля. Цитоплазматические гены дикаря придали культурному виду устойчивость к вирусным заболеваниям.

Очень многое обещает создание гибридов, объединивших цитоплазму обоих родителей с ядром одного из них. Их называют "цибридами". В лаборатории академика АН УССР Ю. Ю. Глебы в Институте ботаники в Киеве слиянием в одной структуре ядра из клеток табака и хлоропластов красавки были созданы плодовитые гибриды. Конечно, это только модельный опыт, но он дает возможность получать растения с совершенно новым сочетанием ядерных и цитоплазматических генов и, следовательно, признаков.

Еще одним интересным подходом, основанным на использовании протопластов, может служить создание искусственных ассоциаций растительных клеток и бактерий. Слияние клеток фотосинтезирующих и азотфиксирующих цианобактерий (сине-зеленых водорослей) с протопластами растений усиливает развитие последних. Таким способом был стимулирован рост культивируемого в искусственных условиях женьшеня.

Культуру растительной ткани можно регенерировать не только из соматических, но и из половых клеток. Почти четверть века назад индийские исследователи добились успеха в культивировании в искусственной среде пыльников и выделенных из них пыльцевых зерен растений семейства пасленовых. Таким образом им удалось вырастить жизнеспособные гаплоидные, то есть содержащие лишь половинный набор хромосом, растения. Культура пыльцевых зерен стала основным источником получения гаплоидных форм декоративных, овощных, зерновых и кормовых видов растений. По предположениям ученых, пыльцевые зерна могут оказаться даже более удобными, чем протопласты, в экспериментах по переносу в растения рекомбинантных ДНК, полученных методами генной инженерии. Причина здесь в том, что в диплоидных соматических клетках проявление работы нового гена будет зависеть от того, какими свойствами - доминантными (подавляющими) или рецессивными (подчиненными) - будет обладать уже сидящий в растении сходный по функции ген - резидент. Какие отношения возникают здесь между гостем и хозяином, мы рассматривали в предыдущей главе. Таким образом, открывается еще один путь к улучшению тех или иных видов растений. Гаплоидные особи стерильны, но из них можно получить плодовитые диплоидные растения, в каждой парной хромосоме которого окажется введенный ген. Разработанная за последнюю пару лет техника слияния протопластов соматических и половых (пыльцевых) клеток дала новые возможности для получения межродовых гибридов.

Итак, мы подошли к моменту, когда техника культивирования клеток и тканей и генная инженерия растений могут напрямую встретиться между собой. Без такой встречи все, чего добивается генная инженерия и о чем пойдет разговор в других разделах этой книги, не имеет смысла.