Глава 7. Трансгенные растения выходят на поля

Раньше на первый план выдвигался уход за землей - удобрения, обработка почвы, словом, именно земледелие. Но ведь главная наша цель в другом - в растение-делии...

Н. И. Вавилов

Люди быстро привыкают к новому, а научно-техническая революция, под флагом которой мы вступаем в грядущий век, и вовсе отучила по-настоящему удивляться успехам прогресса. И все же... Открытия, вчера еще считающиеся чисто фундаментальными, сегодня становятся достоянием практической деятельности человека. Пожалуй, мало еще существует других областей науки, где связь между теорией и практикой была бы столь непосредственна, как в генной инженерии. За каких-то 2 - 3 года пройден громадный путь от модельных экспериментов по переносу в растения генов устойчивости к антибиотикам до создания трансгенных растений с куда более нужными земледельцам свойствами.

Один из первых реальных нынешних успехов генной инженерии растений связан с получением трансгенных растений, устойчивых к насекомым.

Известно, что, еще до того как урожай будет собран, он понесет большие потери от вредителей и болезней. Подсчитано, что на одно растение приходится примерно 10 вредителей. Из великого множества известных видов возбудителей болезней растений на долю грибов приходится не менее 10 тысяч, червей (нематод) - 600, бактерий -около 200, вирусов - около 600 видов. Какими бы большими ни казались эти цифры, они все же намного меньше числа насекомых - вредителей растений. Их описали до 100 тысяч различных видов. По данным организации по продовольствию и сельскому хозяйству при ООН, мировые потери урожаев сельскохозяйственных культур от них сравнимы лишь с потерями от фитопатогенных грибов и достигают 20 процентов. Иными словами, насекомые отнимают у человечества пятую часть урожая, причем чем больше урожай, тем больше потери. И это неудивительно, если учесть их плодовитость и прожорливость. Потомство от одной почти невесомой самки капустной тли, например, при благоприятных условиях уже через несколько месяцев весило бы свыше миллиона тонн. Длительное время человек практически не умел бороться с вредными насекомыми. Выдающийся французский натуралист Жак Анри Фабр писал в начале этого века: "Странное дело! Человек прорезает материки, чтобы соединить два моря, просверливает Альпы, определяет вес Солнца. И в то же время он не может помешать крошечной тле филлоксере губить его виноградники и помешать маленькому червячку попробовать вишни раньше их владельца. Титан побежден пигмеем". Так обстояло дело сравнительно недавно. На помощь пришла химия, создавшая богатый набор "заразоубивающих" средств. Так в буквальном переводе с латинского можно расшифровать слово "пестициды". Пестициды - сборный термин. Он объединяет средства, используемые для борьбы с насекомыми, - инсектициды, с сорными травами - гербициды, с паразитическими грибами и бактериями - фунгициды и другие.

Например, в 1984 году в Танзании нашествие гусениц, размножившихся с катастрофической быстротой, захватило значительные районы страны. Еще недавно человек был бессилен перед таким стихийным бедствием. Однако использование инсектицидов помогло локализовать и потушить этот "пожар".

В настоящее время на мировом рынке имеется свыше 10 тысяч торговых марок пестицидов. Только в США на их производство расходуется около 2,5 миллиарда долларов ежегодно. Этого достаточно для производства препаратов, позволяющих уберечь от потерь урожай на сумму 10 миллиардов долларов в год. Ни один метод защиты растений не может сегодня сравниться с химическим по масштабам и эффективности использования. Тем не менее недостатки применения пестицидов очевидны. Известны многочисленные случаи загрязнения пестицидами окружающей среды, отравления ими человека, гибели животных, нарушения природного равновесия между отдельными представителями животного и растительного мира. Известны такие случаи, когда непродуманное использование пестицидов приводило к размножению некоторых вредителей сельского хозяйства, массовой гибели пчел и другим, мягко говоря, нежелательным последствиям.

Пожалуй, единственная разновидность безвредных пестицидов - это инсектициды, полученные на основе естественных врагов насекомых - бактерий и грибов. Подобные препараты действуют строго направленно, без ущерба для культурных растений, животных и человека. К слову сказать, приоритет в использовании микроорганизмов для уничтожения вредителей растений принадлежит выдающемуся ученому-микробиологу И. И. Мечникову. Ровно 100 лет назад он обнаружил, что враг хлебных полей - хлебный жук - часто поражается грибом-меттархизиумом и предложил метод искусственного разведения этого гриба для борьбы с хлебным жуком и свекловичным долгоносиком. Как тут не вспомнить Джонатана Свифта:

Натуралистами открыты 
У паразитов - паразиты, 
И обнаружил микроскоп, 
Что на клопе бывает клоп, 
Питающийся паразитом; 
На нем другой - ад инфинитум.

По инициативе И. И. Мечникова и молодого энтомолога И. М. Красильщика на Украине тогда же был создан небольшой завод, где выращивали культуру гриба. Между прочим, темп внедрения научного открытия в производство был таков, что нам остается только позавидовать - весь путь от замысла до промышленного выпуска занял всего два года!

Рис. 31

Более 20 лет в мире применяют в качестве инсектицидов бактериального происхождения препараты спор, образуемых бактериями, называемыми тюрингской (по месту обнаружения) бациллой. Инсектицидная активность этих бацилл заключена в белковых кристаллических тельцах, формирующихся в процессе образования спор, в виде которых бациллы и некоторые другие бактерии способны выжить в неблагоприятных условиях. Споры образуются внутри бактериальных клеток. Они окружены многослойной оболочкой, отличаются устойчивостью к высоким и низким температурам, недостатку питания, высушиванию. При попадании в подходящие условия споры прорастают, образуя нормальную клетку. Весь процесс прорастания спор заканчивается за 4 - 5 часов. Стоит гусенице проглотить такую спору, содержащую ядовитый кристалл, как она заболевает и вскоре гибнет. Преимущество инсектицидов этого типа в том, что они нетоксичны для человека и животных, поэтому их можно распылять на растения даже за день до сбора урожая. Кстати, их легко отмыть и инактивировать. Недостаток - сравнительно короткий период активности, требующий повторных обработок. В нашей стране используют несколько препаратов спор, содержащих бациллярный эндотоксин. Энтобактерин, предложенный еще в 50-е годы Всесоюзным институтом защиты растений (ВИЗР) в Ленинграде, оказался эффективным против более 50 видов бабочек. Другой препарат - дендробациллин, созданный в Иркутском университете на основе бактериального штамма, выделенного в тайге во время вспышки размножения сибирского шелкопряда, эффективен против вредителей лесных пород, хлопковых и других совок. К подобным препаратам относятся, например, созданный в Белоруссии против вредителей леса гомелин, предложенные учеными из ВНИИ Сельскохозяйственной микробиологии в Ленинграде битоксибациллин и бактокулицид - против колорадского жука и малярийного комара. Нужно заметить, что питающиеся растениями насекомые относятся к трем отрядам - лепидоптеры (шмели и бабочки), колеоптеры (жуки) и диптеры (мухи, комары). Различные штаммы тюрингской бациллы различаются по спектру своей активности. Большинство активны против лепидоптер, составляющих по численности до 90 процентов общего числа видов насекомых - вредителей растений. Известно, правда, несколько вариантов этих бацилл, вырабатывающих токсин, убивающий колеоптер и диптер.

Свойства бациллярных эндотоксинов теперь довольно детально изучены, а гены по крайней мере некоторых из них выделены. Оказалось, что кристаллики, накапливающиеся в спорах бацилл, растворяются в желудке насекомых. При этом из них выходит крупный белок - протоксин. Этот белок нетоксичен. Чтобы стать токсичным, он должен подвергнуться дальнейшему расщеплению под действием ферментов протеаз, присутствующих в желудке чувствительных насекомых. В результате образуются сравнительно небольшие фрагменты размером примерно в половину исходного белка с активностью эндотоксина. Важно, что этот токсин действует только на определенные виды насекомых, но не на другие организмы. Это означает, что бациллярный токсин - безопасный инсектицид в отличие от многих других, синтезированных химическим путем. К сожалению, он оказался не слишком стабильным в полевых условиях, поэтому и эффективность его действия при распылении на растения колеблется, и ее трудно прогнозировать.

Производство инсектицидов во всем мире обходится примерно в 3 миллиарда долларов ежегодно. В США на защиту растений только от лепидоптер затрачивается до 400 миллионов долларов в год. Ясно, что лучше было бы иметь возможность перенести бактериальный ген в расения, создав тем самым сорта, "не съедобные" для насекомых.

Профессор М. ван Монтегю и его коллеги опубликовали летом 1987 года работу, названную коротко и выразительно: "Трансгенные растения, защищенные от нападения насекомых". Из одного штамма тюрингской бациллы ученые выделили ген (он обозначается bt2), кодирующий синтез эндотоксина, вставили его в векторную плазмиду и перенесли в кишечную палочку. Этот токсин убивает личинки нескольких видов бабочек, в том числе и бражника, поражающего табак. Свои свойства токсин сохранил и тогда, когда начал синтезироваться не в бациллах, а в новом хозяине. Поскольку токсичностью обладает, как уже упоминалось, не весь белок, кодируемый геном bt2, а примерно его половина, то при конструировании химерных плазмид, предназначенных для переноса в растения, в них включали либо целый ген, либо ту его часть, которая кодирует активную половину белка токсина.

Работа проводилась по уже знакомому пути с использованием промежуточного вектора. Ген bt2, полный или урезанный, вставляли в вектор, сконструированный на основе плазмиды pBR322. Встройка гена происходила между содержащимися в векторе концевыми повторами Т-района плазмиды Ti. Впереди гена bt2 оказывался промотор гена синтеза опина, способный обеспечить постоянную работу находящегося под его контролем гена в растении. Позади встроенного гена располагали последовательность, сигнализирующую о конце синтеза мРНК. Кроме того, к гену bt2 подшивали ген устойчивости к канамицину. Это обеспечивало возможность синтеза химерного белка, часть аминокислотной последовательности которого принадлежала эндотоксину, а часть - ферменту, разрушающему антибиотик. Полученную гибридную плазмиду переносили в штамм агробактерий, несущий "обезоруженную" Ti-плазмиду, в которой Т-район замещался на последовательность плазмиды pBR322. Как мы помним, это дает возможность рекомбинации между Ti-плазмидой и гибридной плазмидой с образованием единой молекулы ДНК. Трансгенные растения табака получали методом заражения листовых дисков. Трансформированная растительная ткань образовывала побеги на среде с канамицином.

На листья таких устойчивых побегов помещали по 15 личинок бабочки бражника. По стольку же личинок помещали на листья трансгенных растений, трансформированных плазмидой, несущей только ген устойчивости к канамицину. Через 10 дней оказалось, что все листья растений первого типа остались практически нетронутыми, а у контрольных растений почти целиком изъеденными. На листьях растений, вырабатывающих бактериальный яд, личинки через 18 часов полностью теряли аппетит, а через три дня погибали.

Здесь нужно отметить два момента. Во-первых, в природных условиях значительно меньшее количество насекомых атакует растения. Даже в случае сильной зараженности на листьях табака обнаруживают не более одной личинки. Это означает, что запас прочности, созданный введением в растения гена бациллярного токсина, достаточно высок. Во-вторых, оказалось, что успех достигается только в том случае, когда в растения переносят урезанный, а не полный ген bt2. Причины этого не вполне понятны, ведь превращение полного нетоксичного белка в урезанный токсичный происходит в желудочно-кишечном тракте насекомого. Однако замечено, что полный белок синтезируется в трансгенных растениях в 10 - 50 раз хуже, чем его часть. Количество токсина в растениях составляло в среднем 0,003 процента от общего количества белка. Важно, что и в потомстве таких растений этот уровень полностью сохранился. Подобного же успеха добились и исследователи компании "Монсанто" в США: ген эндотоксина был поставлен ими под контроль сильного промотора вируса мозаики цветной капусты и введен в томаты. Сообщается, что ген бациллярного токсина успешно передан и в другие растения, например картофель и огурцы.

Очень важно, что растения, способные образовывать свой собственный инсектицидный белок, убивают только определенный вид насекомых, не причиняя вреда насекомым-опылителям, в том числе пчелам. Кроме того, этот тип устойчивости поддерживается постоянно в отличие от действия препаратов, время от времени распыляемых на растениях. Вот почему интерес к "ядовитым" трансгенным растениям растет. Начали их создавать и в нашей стране. Работы в этом направлении ведутся под руководством доктора биологических наук Э. С. Пирузян в Институте молекулярной генетики АН СССР в Москве.

Подобные работы открывают и другие интересные перспективы. Например, создание растений-убийц, уничтожающих москитов, комаров и других насекомых, представляющих опасность для человека и животных. Уже получены водоросли, несущие токсин тюрингской бациллы, убивающий малярийного комара анофелеса. Планируется создание гибридных эндотоксинов на основе комбинации генов из бацилл, различающихся по инсектицидной активности. Использование токсинов бацилл - не единственный путь для решения подобных задач. Ученые надеются в недалеком будущем использовать собственные гены растений, помогающие им бороться с насекомыми. Рассматриваются также возможности введения в растения генов некоторых вирусов, убивающих насекомых.

Генная инженерия может гордиться своим успехом: созданы растения, способные "отравить" своих ненасытных соседей - насекомых. Однако стоит еще раз все продумать, прежде чем выпустить таких "убийц" на поля: не станут ли, скажем, съедобные растения, продуцирующие бациллярный токсин, менее вкусными, не изменятся ли к худшему их хозяйственные признаки, а главное, не приведет ли такой "революционный переворот" вековых отношений паразит - жертва к серьезным экологическим сдвигам. Наверняка столкнутся мнения пессимистов и оптимистов. Первые вспомнят про сложность и неоднозначность взаимосвязей и взаимных влияний одних вредителей сельскохозяйственных культур на другие. Приведут немало случаев, когда вмешательство человека в регулирование численности одного вредителя способствует появлению различных, не всегда предсказуемых нарушений по всей экосистеме.

Рис. 32

Например, в США для подавления грибковых заболеваний сои использовали фунгицид беномил. Все шло неплохо, пока не заметили, что резко усилилась численность гусениц одной из вредных бабочек. Оказалось, что в природе этих гусениц убивал гриб, паразитирующий на сое. Гриб убили, но вместо одной проблемы немедленно возникла другая - срочно нужно было решать, как избавиться от вредных гусениц. Или еще один из множества подобных примеров. В Шри Ланке с помощью химически полученного инсектицида уничтожали жука-точильщика, подъедающего стебли чайных кустов. Жука действительно потеснили, но появилась новая напасть - резко размножился один из видов гусениц. Теперь срочно нужно было тушить "гусеничный пожар". Потушили, а тут другая беда - откуда-то взялись клещи, да еще в угрожающих количествах. Так, уничтожение каких-нибудь одних вредителей сразу обнаруживает в природе новые, подчас неожиданные взаимосвязи. Не забудем также, что инсектициды, как бы хороши они ни были, действуют не постоянно и не со 100%-ной эффективностью. Это значит, что какой-то шанс выжить у паразита имеется (паразит-то он, конечно, паразит, но все же для чего-то природа его придумала, выходит, нужен он ей).

В случае с трансгенными растениями дело другое - тут речь может идти и о полном уничтожении. Добро, если, скажем, вредитель культурного растения сумеет переключиться на сорняк, а вдруг нет? Да и на сорняки сейчас идет облава, и здесь генной инженерии не терпится сказать свое веское слово. Нет, заключит пессимист, торопиться в таком деле нельзя, надо еще семь раз отмерить да сто раз подумать. Думайте, думайте, ответит оптимист. Но вы же не отрицаете известную пользу инсектицидов, гербицидов, других пестицидов. Сегодня пока всерьез никто не ставит вопрос о том, чтобы от них полностью отказаться. Несмотря на все возможные нежелательные последствия для окружающей среды, для экологии, с вредителями сельского хозяйства бороться необходимо. А путь, предлагаемый генными инженерами, это, по существу, путь постепенного сокращения производства пестицидов и даже отказа от них во многих случаях. Сколько средств сохранится и может быть с пользой перераспределено, хотя бы на расширение работ в области той же генной инженерии. И что не менее важно, перестанут люди в таких масштабах поля обрабатывать химией. Что же до взаимосвязей в природе, то она сама достаточно хитра и изворотлива. Что-нибудь придумает. Желательно, правда, чтобы это "что-нибудь" было хорошим, а то появятся насекомые, которые "отравленные" растения за лакомство будут считать, и завертится новая карусель. Тут, правда, оптимист, спохватится и замолчит, испугается, что спутают его с пессимистом. Но, если говорить совсем серьезно, поступь науки остановить нельзя - нащупав что-то, она обязательно будет доводить это до конца. Важно использовать могущество науки на благо человеку. Ну а теперь, после этой возвышенной фразы, поговорим о другом реальном успехе генной инженерии растений - создании растений, устойчивых к гербицидам.

Рис. 33

Вспомним прежде, однако, что гербициды это химические средства борьбы с сорняками. На их производство к 1990 году во всем мире будет затрачено 7,5 миллиарда долларов. Первые химические гербициды были синтезированы в начале 30-х годов нашего века. Еще через 10 лет появился, например, 2,4-Д, до сих пор широко применяемый для уничтожения сорняков после всходов хлебных злаков. С тех пор каждое новое десятилетие давало в руки аграрникам все более мощные и универсальные инструменты для борьбы с сорняками. В начале 70-х годов появилось несколько принципиально новых и высокоэффективных гербицидов. Один из наиболее распространившихся - глифосат (производное аминокислоты глицина), является активным началом нескольких запатентованных марок гербицидов, используемых для послевсходового употребления. У глифосата немало преимуществ. Он эффективно действует против многолетних сорняков с длинными корнями типа пырея и осоки, быстро дезактивируется в почве микроорганизмами, практически нетоксичен для животных и человека.

Другой очень эффективный гербицид - хлорсульфурон из класса сульфанилмочевины уничтожает многие широколистные сорняки и сравнительно быстро распадается в почве. Гербицидом нового типа, имеющим природное происхождение, можно считать биалофос, или фосфиноицин. Это вещество вырабатывается одним из видов грибов стрептомицетов. Всего же в настоящее время в сельском хозяйстве во всем мире используют около 200 типов гербицидов. Гербициды заметно облегчили труд земледельцев, освободив их от вековой повинности выпалывать сорняки. Но беда в том, что универсальных гербицидов, способных отличать сорняк от культивируемых растений, пока не существует. Отсюда возникает задача - создание сортов культурных растений, устойчивых к гербицидам, генно-инженерными методами. Чтобы ее решить, надо, в частности, знать механизм действия отдельных гербицидов, а затем уже на основе этих знаний разрабатывать тактику конструирования трансгенных растений. Оказалось, что мишенью действия гербицидов служат те или иные ферменты растений, связанные с процессами фотосинтеза либо с синтезом аминокислот. Глифосат, например, подавляет активность фермента, участвующего в биосинтезе так называемых ароматических аминокислот - фенилаланина, триптофана и тирозина. Хлорсуль-фурон подавляет фермент, ответственный за синтез аминокислот валина и изолейцина. Биалофос угнетает синтез глутаминовой кислоты. К счастью, богатая своим разнообразием природа любит тиражировать собственные хорошие идеи. Поэтому как ни далеко отошли друг от друга в ходе эколюции бактерии, грибы и растения, но пути биосинтеза одних и тех же аминокислот у них часто очень близки. Неудивительно поэтому, что, когда американские ученые из компании "Калген" во главе с Лука Комаи сумели получить из бактерий сальмонелл мутанты, устойчивые к глифосату, оказалось, что устойчивость связана с небольшим изменением в том же самом ферменте, который является мишенью для действия гербицида в чувствительных растениях. Примерно то же произошло и с хлорсульфуроном, только устойчивые к гербициду мутанты были выделены у дрожжей.

В силу каких же причин организм приобретает устойчивость к любому яду? Во-первых, можно индуцировать мутацию в гене, который кодирует фермент, служащий мишенью для действия яда. В результате яд не в силах инактивировать измененный фермент, а значит, причинить вред мутантному организму. Во-вторых, можно увеличить продукцию фермента-мишени настолько, что яда, достаточного для убивания обычных организмов, окажется мало, чтобы справиться с избытком молекул фермента. Можно наконец заставить организм вырабатывать вещество, инактивирующее яд. Все эти подходы используются генными инженерами при создании устойчивых к гербицидам растений.

Пригодился опыт, накопленный при выделении и переносе в растения бактериальных генов антибиотикоустойчивости. Из сальмонелл, устойчивых к глифосату, был выделен мутантный ген и вшит в состав вектора, полученного на основе плазмиды Ri Бактериальный ген оснастили всеми необходимыми для его работы в растениях сигналами и перенесли в клетки табака. Растения, полученные при регенерации трансформированных клеток, содержали мутантный бактериальный фермент и оказались в несколько раз более устойчивыми к глифосату, чем контрольные. Сейчас ученые работают над тем, чтобы обычные растения отличались от трансгенных по устойчивости к гербициду раз в 10 - 30, и тогда производство можно будет поставить на коммерческую основу.

Исследователи из американской компании "Монсанто" решили достигнуть той же цели иначе, заставив растения вырабатывать столько фермента-мишени, чтобы яда не хватало убить его. Они сумели выделить из клеток петунии мРНК гена, кодирующего синтез фермента, инактивируемого глифосатом. По этой мРНК с помощью обратной транскриптазы была синтезирована ее полная ДНК-копия, включающая участок, кодирующий транзитный пептид, обеспечивающий доставку фермента в хлоропласты, где он работает наиболее эффективно. ДНК-копию включали в векторную плазмиду под контроль сильного промотора, взятого из генома вируса мозаики цветной капусты. Трансформированные таким химерным геном растения петунии синтезировали в 20 - 60 раз больше фермента-мишени, чем нормальные.

Регенерированные из этих тканей растения не погибали, если их обрабатывали глифосатом в дозе, в четыре раза больше той, что достаточна для гибели контрольных растений. Близкий подход был использован и в случае получения растений табака, устойчивых к хлорсульфурону. Ген, кодирующий синтез фермента-мишени, выделили из дрожжей, устойчивых к гербициду, присоединили к сигнальным элементам знакомого нам гена малой субъединицы РУБИСКО и перенесли в составе вектора на основе плазмиды Ti в табак. Трансформированный каллус рос на средах, содержащих в три раза больше гербицида, чем мог выдержать контрольный каллус.

Как видим, можно лишить гербицид точки опоры, изменив фермент-мишень, а можно поставить его в положение сладкоежки, которому дали сразу большую коробку конфет - он ел, ел да и объелся. Но лучше всего, конечно, попросту инактивировать, разрушить гербицид, проникший в культурное растение. Этот подход был использован в случае биалофоса. Он производится стрептомицетами одного вида и убивает представителей другого. Почему же биалофос не убивает своего "родителя"? Оказывается, что стрептомицеты этого вида могут синтезировать не только биалофос, но и разрушающий его фермент ацетилтрансферазу. Ген, кодирующий его синтез, выделен из стрептомицетов - продуцентов биалофоса и введен в стрептомицеты, чувствительные к этому яду, в составе гибридной плазмиды. Трансформированные клетки оказались в 500 раз более устойчивыми, чем контрольные. Исследователи, работающие под руководством профессора ван Монтегю, осуществили перенос того же гена в растения и добились их 100%-ной устойчивости к биалофосу.

Арсенал генов устойчивости к гербицидам постоянно пополняется. Их источником, например, как показали исследования, проведенные на кафедре генетики МГУ под руководством члена-корреспондента АН СССР С. В. Шестакова, могут стать синезеленые водоросли (цианобакте-рии). Получены мутанты цианобактерий, устойчивые к параквату - гербициду, уничтожающему многие сорняки и быстро дезактивирующемуся в почве, а значит, сравнительно безопасному с точки зрения охраны окружающей среды. Выделены также мутанты, устойчивые к триазинам - гербицидам, действующим через почву на сорняки в посевах пшеницы, кукурузы, сахарной свеклы, но не затрагивающим культурные растения. Появились сообщения о том, что гены устойчивости к этим гербицидам, подавляющим в растениях процессы фотосинтеза, перенесены с помощью Ti-плазмид из цианобактерий в клетки табака. Это немалый успех, открывающий путь для создания культурных растений, характеризующихся множественной устойчивостью к гербицидам, различным по механизму своего действия.

Мы видим, что устойчивость к насекомым и гербицидам - пример вполне конкретных задач, в решении которых генной инженерией растений достигнут наиболее очевидный прогресс. Появились сообщения о том, что создан картофель, устойчивый к колорадскому жуку, конструируются растения - продуценты инсулина и других гормонов человека. Есть и другие области, где успех, по всей видимости, тоже не за горами. Но о них пойдет речь в заключительной главе этой книги.