Глава 6. От трансформированной клетки к трансгенному растению

Метод важнее результата потому что с его помощью может быть получено много результатов.

Л. Д. Ландау

Природа, как известно, имеет свой способ генной инженерии растений. Она подарила агробактериям Ti- и Ri-плазмиды, снабдив эти плазмиды остроумным механизмом, с помощью которого они "забрасывают" в растения гены и так переделывают себе на пользу свою жертву, что она становится производителем нужных бактериям питательных веществ.

Вводить новые гены в растения с помощью агробактерий можно несколькими путями. Наиболее естественный из них - просто заражение пораненных растений. Этот способ детально изучен, поскольку именно он ведет к образованию корончатогалловых опухолей. Однако клетки галлов, как уже говорилось, не могут регенерировать в нормальное растение. Этому мешает активное образование фитогормонов под контролем онкогенов, присутствующих в Т-ДНК. Потому ученым пришлось искать иные возможности.

Начали с попыток как-то обойти неспособность опухолевых клеток и образующихся из них каллусов к регенерации. К счастью, всякое правило имеет исключения. Ими оказались тератомы - опухоли-уродцы, образующиеся у растений, зараженных некоторыми штаммами агробактерий. Они состоят из смеси дифференцированных клеток, способных дать начало различным частям растения. Если этих уродцев привить к здоровому корню, можно получить растение, клетки которого сохраняют способность к образованию опина и гормононезависимому росту в культуре. Таким путем были получены первые растения, в каждой клетке которых присутствовали и работали чужеродные гены, введенные в данном случае естественным путем - через агробактерию. Правда, потомство таких растений утрачивало новый признак, потому что, как оказалось, введенный ген не смог пройти через мейоз - процесс, необходимый для образования гаплоидных половых клеток. Очевидно, природа ставит мощный заслон распространению опухолевых генов в потомстве, ограничивая их присутствие только клетками корончатых галлов первично пораженного растения. Если это так, то повреждение онкогенов Ti-плазмид должно позволить другим генам, входящим в состав Т-ДНК, включая гены опинов либо иные специально вставленные гены, наследоваться в потомстве. Именно эти рассуждения стали теоретической основой создания "обезоруженных", то есть лишенных онкогенов Ti-плазмид вроде pGV3850, о которой речь шла в предыдущих главах. Несущие ее агробактерий не вызывают образования корончатых галлов, но клетки в зоне инфицированной раны образовывали нопалин. Это означало, что в них проникла "обезоруженная" Т-ДНК. Такие клетки стали культивировать in vitro, а образовавшийся из них каллус переносили на среду, содержащую фитогормоны в соотношении, стимулирующем образование побегов. Подросшие побеги срезали и укореняли в почве. От 10 до 70 процентов укоренившихся растений обнаружили способность к образованию нопалина. Это очень важное наблюдение означало, что если в Т-ДНК нет онкогенов, то включившие ее в свой геном клетки регенерируют в целое растение, способное затем передать эту Т-ДНК следующему поколению. Так "обезоруженная" Ti-плазмида помогла установить две принципиальные вещи. Во-первых, лишенная онкогенов Т-ДНК не мешает регенерации растительной клетки. Во-вторых, такая "дефектная" Т-ДНК способна пройти через мейоз и наследоваться в потомстве. Оба эти факта открыли путь для создания настоящих трансгенных растений, способных передавать потомству введенный в них ген.

Как же доставить в растения рекомбинантные ДНК? На сегодняшний день существует два способа. Один из них основан на использовании агробактерий - природных переносчиков генов. Другой - на использовании препаратов изолированных векторных ДНК, несущих включенные в них гены, предназначенные для переноса в растения. Для того чтобы переносить гены, агробактерий вовсе не обязаны иметь дело с целым растением. Достаточно выдержать некоторое время бактерии совместно с протопластами растительных клеток. Этот метод получил название кокультивирования. Впервые он был применен венгром Ласло Мартеном, работавшим в Лейденском университете в Голландии под руководством профессора Р. Шильперурта. "Голые" протопласты, как мы помним, намного более проницаемы для крупных молекул, вроде ДНК, чем "одетые" клетки. Поэтому протопласты растительных клеток стали во многих работах той исходной точкой, от которой, как от печки, можно "протанцевать" весь путь: трансформированный протопласт - целая клетка - культура каллусной ткани - регенерация побегов - укоренение - трансгенное растение - потомство, полученное путем самоопыления трансгенных растений, - сорт. Первые сообщения об успешной информации протопластов появились около 10 лет назад. Правда, вероятность успеха была тогда невелика: примерно лишь один из тысячи и даже десяти тысяч протопластов оказывался трансформированным. Теперь техника трансформации ушла далеко вперед и ввести ДНК удается в каждый десятый протопласт и даже много чаще.

Обычно используют протопласты на второй-третий день после их получения. За последующие примерно двое суток совместного культивирования агробактерии успевают присоединиться к протопласту и передать свою Т-ДНК в растительное ядро иногда даже не в одной, а в нескольких копиях. Затем протопласты отмывают от ставших ненужными бактерий, а чтобы избавиться от них наверняка, добавляют в культуральную среду какой-нибудь антибиотик, убивающий бактерии, но не растительную клетку. Часто с этой целью используют антибиотик пенициллинового типа - карбенициллин. Теперь протопластам ничего не мешает регенерировать и образовывать на плотной питательной среде колонии. Как только колонии немного подрастут, их переносят на новую, уже селективную среду. Если в трансформации участвует полноценная Ti-плазмида, трансформированные клетки формируют колонии на среде, не содержащей добавок фитогормонов, - для роста и деления клеток вполне хватает того, что нарабатывается под контролем генов в Т-ДНК. Если же используется система промежуточного вектора, несущего ген антибиотикоустойчивости, и "обезоруженная" Ti-плазмида, то трансформированные клетки формируют колонии на среде, содержащей соответствующий антибиотик. Даже небольшие колонии трансформантов, диаметром всего 1 - 3 миллиметра, содержат достаточно клеток, чтобы из них выделять ДНК, РНК и белок для дальнейшего анализа присутствия чужеродного гена и его экспрессии.

На сегодня метод кокультивирования остается одним из основных и лучших для переноса генов в растения посредством агробактерии. Но у него есть и недостатки. Клетки многих видов растений, в том числе и злаковых, с трудом поддаются протопластированию, их клеточную стенку сложнее разрушить, а главное, их протопласты не удается регенерировать. Значит, возможности получения трансгенных форм из трансформированного протопласта для этих растений пока нет. Кроме того, кокультивирование - довольно длительная процедура, в ходе которой в части клеток с большей вероятностью, чем при использовании тканевых культур, могут возникнуть различные нежелательные перестройки хромосом.

Избежать этих неприятностей помогает разработанный позднее метод трансформации кусочков листьев. В листьях находится множество так называемых мезофильных клеток, способных легко регенерировать. Оказалось, что агробактерии эффективно переносят плазмидные гены в клетки, если небольшие кусочки листьев, стерильно вырезанные в форме дисков, просто поместить в жидкую питательную среду, содержащую бактерии, а затем, не отмывая от них, положить в чашки Петри на поверхность твердой питательной среды, содержащей фитогормоны в соотношении, оптимальном для индукции роста побегов, и антибиотик, устойчивость к которому кодирует трансформирующий ген (например, канамицин). Затем диски переносят на среду, где тоже находится канамицин для отбора трансформированных клеток, но с добавлением карбенициллина, чтобы убить бактерии. За это время процесс трансформации успел произойти, и бактерии становятся ненужными (к тому же, если дать им возможность размножаться и дальше, они вообще могут забить растительную культуру). В случае, например, петунии за 2 - 3 недели образуются побеги достаточного размера. Их обрезают, укореняют и переносят в почву.

У генных инженеров растений уже появились свои любимые объекты, с которыми они работают охотнее всего. К ним относится арабидопсис - маленькое цветущее растение, своего рода растительная дрозофила. Оно быстро размножается - жизненный цикл всего 6 недель, а его геном сравнительно невелик: состоит всего лишь из 70 миллионов пар оснований (для сравнения заметим, что геном той же дрозофилы ровно в два раза больше). Кроме того, в ДНК арабидопсиса в отличие от большинства растений сравнительно немного повторяющихся участков, что облегчает ее анализ. Как и другие двудольные растения, арабидопсис может заражаться агробактериями и образовывать опухоли. На примере арабидопсиса проследим более детально, как с помощью метода листовых дисков в растения из агробактерий переносят чужеродный ген.

В работе, проведенной недавно в США, растения арабидопсиса трансформировали с помощью агробактерий, несущих промежуточный вектор. В данном случае в клетках бактерий находилась коинтегративная Ti-плазмида pGV3850-pAK1003. Плазмида несла ген устойчивости к антибиотику типа канамицина, подставленного под контроль активного в растениях промотора, что позволило следить за появлением указанного гена в растениях по их устойчивости к действию антибиотика.

Рис. 25

Семена арабидопсиса помещали в чашки Петри на твердую среду с необходимыми для проращивания семян компонентами. На поверхности среды семена давали проростки. Листочки, образующиеся у двух- трехнедельных проростков, нарезали на диски и помещали в суспензию клеток агробактерий, содержащих гибридную плазмиду. Для того чтобы трансформация шла эффективнее, бактерии предварительно инкубировали с ацетосирингоном. Как уже рассказывалось в главе 2, это вещество обнаружено в соке пораненных двудольных растений. Оно активирует гены вирулентности Ti-плазмиды, ответственные за ее перенос из бактерий в растения. Ацетилсирингон был использован для повышения эффективности проникновения чужеродной ДНК в клетки арабидопсиса.

Рис. 26

После того как листовые диски пару дней подержали в суспензии агробактерий, активированных ацетилсирингоном, их отмывали в среде, содержащей антибиотик цефотаксим, убивающий бактериальные, но не действующий на растительные клетки. Далее диски помещали примерно на неделю на специальную агаризованную среду, индуцирующую образование каллуса, добавляя в нее цефотаксим, так сказать для верности, чтобы убить оставшиеся бактерии. Примерно через неделю из листовых дисков на этой среде образовывались горошинки зеленой каллусной ткани. Эти горошинки аккуратно переносили на свежую среду, способствующую дальнейшему росту каллуса. Но теперь, кроме цефатоксима, в нее добавляли антибиотик, устойчивость к которому контролировалась геном, включенным в состав гибридной плазмиды, находящейся в агробактериях. В описываемых опытах им был генитицин (G418) - близкий, но более активный родственник канамицина. Если во время инкубации листовых дисков с бактериями эта плазмида сумела проникнуть в растительные клетки, а ген устойчивости к G418 включился в растительный геном и заработал в новом хозяине, то трансформированный каллус должен расти в присутствии антибиотика. Если же трансформация не произошла, растительные клетки погибнут. Вот на этом этапе как раз и выявляется частота трансформации. Сравнивают, сколько горошинок каллуса продолжает расти на среде с G418 и сколько гибнет. Выяснилось, что обработка бактерий ацетосирингоном привела к тому, что трансформированными оказались 50 - 60 из каждых 100 каллусов, а без ацетосирингона - только 2 - 3. Еще через одну-две недели подросший, устойчивый к G418 каллус переносят на среду, состав которой стимулирует его дифференцировку, формирование из аморфной каллусной ткани побегов. Еще через шесть недель примерно половина пересаженных каллусов образует цветущие побеги. Для полной регенерации целого растения побеги на две недели переносят на третью среду, богатую ауксином, стимулирующим образование корней. Регенерировавшие растения пересаживают в горшочки с землей, помещают в теплицу, где через 21 день они дают семена. Анализ проростков из этих семян показал, что полученный растениями при трансформации признак устойчивости к антибиотику передается потомству по обычным законам менделевского наследования единичного доминирующего признака: почти все проростки оказались устойчивыми к канамицину и к G418.

Однако же это очевидное доказательство успеха трансформации не удовлетворило ученых. Специальными опытами они установили, что все устойчивые к антибиотикам растения действительно содержали активность ответственного за эту устойчивость фермента НФТ, кодируемого геном kan, включенным в гибридную плазмиду. Более того, анализ ДНК из этих растений подтвердил наличие в ней района Т-ДНК, содержащего ген устойчивости. Только получив всю сумму таких доказательств, исследователи смогли с уверенностью утверждать, что они осуществили перенос в растение чужеродного гена, который сохранился в мейозе, передался в гаметы и в потомство.

Как бы ни был метод листовых дисков хорош, но, как говорится, предела совершенству нет. Возможно, что сменит его новый метод - тонких срезов ткани с поверхности цветковых боковых побегов. Срезы помещают в среду для регенерации корней вегетативных или цветковых побегов. Режим культивирования задан столь точно, что цветковые побеги удается получить так же просто, как и вегетативные. Эти цветковые побеги быстро заканчивают свой цикл в культуре и при переносе в почву. В итоге плодоносные растения можно получить за 6 недель, а поколение семян - за 8 недель против 12 - 14 недель в случае использования техники дисков.

Голландские и английские исследователи достигли явного успеха в получении трансгенного картофеля. Они сумели ввести бактериальный ген устойчивости к канамицину в широко распространенные в этих странах сорта картофеля и отобрать трансгенные формы, отличающиеся от нормальных растений лишь одним - в них активно синтезировалась бактериальная НФТ. Вместо протопластов ученые трансформировали диски картофельных клубней, из которых, оказалось, побеги получить намного проще, чем из каллусной ткани, образованной из трансформированных протопластов или листовых дисков. Причем побеги удается получить уже через 4 - 6 недель, тогда как при использовании других методов требуется в два-три раза больше времени.

А нельзя ли вводить гены в растения с помощью агробактерий еще более простым способом, обойти сложности, связанные с культивированием клеток и тканей растений и их регенерацией? Арабидопсис помог недавно ответить и на этот очень важный в методическом отношении вопрос. Оказалось, что такая возможность есть. Клетки агробактерий, несущие ту же самую гибридную плазмиду pGV3850 - рАК1003, что использовалась для заражения дисков из листьев арабидопсиса, стали культивировать совместно с его пророщенными семенами. Растения, образовавшиеся из таких семян, дали потомство, устойчивое к G418. Перенесенный признак наблюдался и у большей части растений третьего поколения. В устойчивых клетках обнаруживались инактивирующий антибиотик фермент НФТ и Т-ДНК, присутствовавшая в промежуточном векторе. Похоже, что удалось создать быструю и надежную систему для трансформации растений. Ученые работают сейчас над тем, чтобы использовать ее для переноса генов в различные ценные культуры, включая зерновые.

Как же обстоит дело с генно-инженерными подходами к однодольным растениям? В природных условиях подавляющее большинство из них, в том числе и зерновые, по-видимому, нечувствительны к заражению агробактериями. Во всяком случае, в природе ни корончатых галлов, ни "бородатого" корня у них не встречается. Поэтому считалось, что плазмиды Ti и Ri нельзя использовать в качестве векторов для переноса генов в однодольные растения. Категоричность такого заключения была, однако, поколеблена серией проделанных почти одновременно в нескольких лабораториях работ.

В 1984 году группа профессора Р. Шильперурта сообщила, что заражение растений из родов хлорофитов и нарциссов некоторыми вирулентными штаммами агробактерий хотя и не ведет к образованию корончатых галлов, но все же вызывает небольшое набухание ткани в инфицированной ране и, что более важно, появление в этой ткани опина именно того типа, к которому относится взятый для заражения штамм. Почти одновременно Дж. Шелл и М. ван Монтегю также сумели вызвать нечто вроде опухоли у другого представителя лилиецветных - спаржи, зараженной штаммом A. tumefaciens нопалинового типа. Опухоли, правда, возникали примерно лишь у одного из десяти зараженных растений, но зато могли, как им и положено, расти in vitro без добавления фитогормонов. Это означало, что на растениях действительно образовалась опухоль корончатогаллового типа. Биохимический анализ показал, что в них идет синтез нопалина, а ДНК из опухолевых клеток содержит Т-ДНК.

Все эти наблюдения всколыхнули надежды многих ученых. Еще бы, ведь если такое удается с одними однодольными, то почему бы не попробовать и с другими, более существенными для человека, чем спаржа и нарциссы. В 1986 году два исследователя из университета Толедо в США А. Грейвс и К. Гольдман получили свидетельства тому, что ДНК Ti-плазмиды может проникать в клетки кукурузы и экспрессироваться в них. Для заражения было использовано два типа агробактерий, один из которых содержит Ti-плазмиду нопалинового, а другой - октопинового типа. Семена кукурузы проращивали, а проростки инфицировали бактериями. Зараженные растения не образовывали опухолей, однако через одну-две недели в кусочках ткани, вырезанных из проростков в местах их заражения, в особенности в районе верхушечной меристемы, можно было обнаружить присутствие опинов - нопалина или октопина в зависимости от того, какой тип плазмиды Ti находился в бактериях, использованных для заражения. Важно, что в контрольном эксперименте, когда для инфицирования проростков использовали невирулентный мутант агробактерий, в котором у Ti-плазмиды повреждены гены, ответственные за ее перенос в растения, в тканях растений опины не обнаруживались. Эти опыты показали, что в принципе злаковую культуру можно трансформировать с помощью ДНК Ti-плазмиды и что, следовательно, эта ДНК может служить вектором для переноса в однодольные новых генов. Вскоре справедливость этого вывода была подкреплена теми же авторами в отношении еще одной группы однодольных растений - гладиолусов. Однако использованный в обеих этих работах показатель эффективности трансформации - появление в клетках ферментов синтеза опинов - требовал специального биохимического обследования каждого инфицированного проростка.

Конечно, много лучше, если бы факт трансформации можно было бы легко обнаружить по изменению какого-либо видимого на глаз признака растений. Именно поэтому сообщения группы исследователей из Швейцарии и Англии сразу же привлекли к себе внимание. Ученые открыли, что вирусы способны вызывать болезни растений не только путем их прямого заражения, но и через посредника - агробактерию. ДНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV) как бы пряталась в Ti-плазмиде. "Ничего не подозревающие" растения вместе с Т-ДНК получали вирус, который немедленно выходил "из укрытия" и вызывал все симптомы болезни. Такой путь проникновения вируса в растение назвали агроинфекцией. Впервые он был продемонстрирован в отношении двудольного растения турнепса.

Вскоре те же исследователи решили использовать агроинфекцию, чтобы окончательно ответить на вопрос, могут ли Ti-плазмиды служить переносчиками генов в однодольные растения. Они сумели этим способом перенести в кукурузу ДНК вируса MSV, вызывающего характерную исчерченность листьев, чтобы об эффективности проникновения Т-ДНК в растительные клетки можно было судить, что называется на глаз.

Исследователи сконструировали несколько гибридных плазмид, содержащих фланговые участки Т-района, между которыми были помещены два расположенных один за другим повтора ДНК вируса MSV. Такие плазмиды ввели в клетки агробактерий, уже несущих полноценную плазмиду Ti. Теперь агробактерия содержала две плазмиды, одну большую - Ti и одну маленькую гибридную с ДНК вируса MSV. Такими бактериями заражали стебли или листочки 10-дневных проростков кукурузы. Признаки болезни появились через 7 - 18 дней после заражения. Специальный анализ показал, что в заболевших растениях содержалась вирусная ДНК. Появление симптомов болезни однозначно свидетельствует, что по крайней мере одна молекула вирусной ДНК проникла в растительную клетку и размножилась в ней. Агроинфекция оказалась несравненно более чувствительной системой, чем использовавшиеся ранее. Ученые поставили также такой опыт: из гибридной плазмиды, несущей ДНК вируса MSV, убрали 25-членные концевые повторы, без которых Т-ДНК не может встроиться с геном двудольного растения. Оказалось, что в этом случае агроинфекция неэффективна, и растения остались здоровыми. Таким образом, проникновение вирусной ДНК в кукурузу, опосредованное бактерией-помощником, происходит по тем же законам, что и в случае обычного заражения агробактериями двудольных растений. Очевидно, что агроинфекция открывает новые возможности для переноса генов в злаковые растения и, что не менее существенно, она дает вполне определенный ответ на вопрос о том, могут ли в принципе агробактерии служить переносчиками генов в однодольные растения.

Рис. 27

Почему же все-таки в природе у однодольных корончатогалловых опухолей не образуется? Причин здесь может быть несколько. Известно, что однодольные, в особенности злаки, менее чувствительны к сдвигам в балансе фитогормонов. Поэтому проникновение в их геном генов фитогормонов Ti-плазмиды не вызывает бесконтрольного роста и деления клеток, приводящих к образованию корончатых галлов. Выходит, что агробактериям нет смысла вносить свои Т-районы в однодольные - "фабрики опинов" ведь все равно не получится. Называют и другие причины устойчивости клеток однодольных - отсутствие на их поверхности рецепторов для прикрепления бактерий и неспособность вырабатывать соединения типа ацетосирингона, активирующие гены Vir-области Ti-плазмид, а значит, и их перенос.

Рис. 28

Последняя гипотеза оказалась, вероятно, правильной. Ученые из группы молекулярной биологии растений из университета во Франкфурте-на-Майне, в ФРГ, работали над возможностью использования агробактерии для генной инженерии ямса - одной из самых важных для стран третьего мира пищевых культур. Срезы луковиц ямса обрабатывали соком из пораненного картофеля, содержащим ацетосирингон, и заражали бактериями, несущими плазмиду Ti нопалинового типа. Через 2 - 3 месяца на поверхности срезов образовывались типичные корончатые галлы. В их ткани синтезировался нопалин, а в ДНК обнаруживался участок, идентичный Т-району Ti-плазмиды. Таким способом удалось получить прямые доказательства, что плазмидная ДНК может встраиваться в геном однодольных растений, а ее онкогены и гены синтеза опинов могут в них работать. Стоит только "смазать" однодольные раневым соком двудольных - и "тележка покатится".

Все рассмотренные методы введения гена в растения основаны на использовании природного пути переноса - через агробактерии. Нельзя ли обойтись без этого посредника и трансформировать растительные клетки непосредственно изолированной ДНК? Такая возможность почти полвека назад доказана для самих бактерий (вспомним опыты Эйвери, описанные в главе 3), а десять лет назад - для дрожжей и млекопитающих. Возможность подобным путем трансформировать растения открыла бы дополнительные пути для их преобразований, расширила бы круг растений, в которые можно переносить желаемые гены.

Стоит сказать о том, что попытки трансформировать растения с помощью изолированных ДНК начались еще до того, как были открыты Ti-плазмиды и созданы методы прямого переноса генов в составе векторов. В начале 70-х годов появилось несколько работ, продемонстрировавших возможность переноса и функционирования в растениях чужеродной ДНК. Вначале семена и пыльца, а за ними культивируемая in vitro каллусная ткань и протопласты стали мишенями, куда стремились "попасть" ученые, чтобы ввести в растения голую ДНК. Их вдохновляли результаты американца Г. Меррила, опубликовавшего в 1971 году работу, где сообщалось об опытах по исправлению наследственной болезни человека - галактоземии, выражающейся в неспособности новорожденных усваивать сахар-галактозу. Группа Меррила решила ввести в "больные" клетки человека ген из кишечной палочки, кодирующий фермент галактозидазу, обеспечивающий усвоение галактозы. В качестве переносчика использовали бактериофаг, в ДНК которого находился прихваченный от бактерий ген галактозидазы. Ученые известили научный мир о своей удаче: клетки больного галактоземией восстанавливали нормальную способность к усвоению галактозы, в них обнаруживалась ранее отсутствовавшая галактозидаза. Работа имела шумный успех, пресса писала об открытии новой эры в лечении наследственных дефектов, о возможностях генетических преобразований различных организмов. Однако довольно скоро пришло разочарование - работу Меррила не удавалось больше повторить ни ему самому, ни другим ученым, пытавшимся это сделать. Тем не менее ряд крупных специалистов в области растений решили применить подход Меррила для переноса чужеродных генов в растения. Заметим, что в это время еще не были открыты плазмида Ti и ее роль переносчика гена в растения, да и сама генная инженерия находилась в зародышевом состоянии. Группа австралийского исследователя Колина Доя попыталась с помощью тех же самых бактериофагов, которые использовал и Мерилл, перенести ген галактозидазы E. coli в каллусную культуру гаплоидных клеток томата и арабидопсиса. Клетки этих растений неспособны использовать галактозу в качестве источника углерода и даже гибнут в ее присутствии. Ученые обработали каллусную ткань суспензией фаговых частичек, несущих ген галактозидазы, после такого воздействия каллусная ткань хотя и не выглядела вполне здоровой, но все же могла расти на среде с сахаром-"убийцей". Проходило всего несколько недель, и растительные ткани вновь утрачивали устойчивость к галактозе. Исследователи так и не смогли по-настоящему разобраться, в чем причины как появления, так и исчезновения нового признака, да и воспроизвести сам феномен удавалось редко. Механизм наблюдавшегося явления оставался непонятен.

Рис. 29

Скорее всего, результаты Доя, как и Меррила, были лишь одним из тех "подарков дьявола", которые, как мы уже знаем, к несчастью, иногда получают ученые. И все же это полное надежд время оставило свой след - у ученых появилась общая цель - перенос чужеродных генов в различные организмы да термин "трансгеноз". Под ним стали понимать сам факт переноса генетической информации из одной клетки в другую с ее последующей экспрессией независимо от того, какой механизм лежит в основе наблюдаемых событий. Прошло совсем немного времени и на сцену вышла генная инженерия с ее четкими, программируемыми методами конструирования и переноса рекомбинантных ДНК. Ученым не было больше нужды полагаться на бактериофаги. В их руках оказались куда более надежные векторы для переноса генов в растения.

В 1980 - 1982 годах была сделана попытка прямо ввести ДНК в растительную клетку. ДНК Ti-плазмиды выделили из агробактерий и ввели ее в протопласты петунии в присутствии искусственного полимера аминокислоты орнитина, способствующего взаимодействию ДНК с протопластом. Отбор трансформантов вели по признаку независимого от фитогормонов роста. Очень медленно и с очень низкой частотой (примерно 1 трансформированная клетка на миллион, взятых в опыт) формировался гормононезависимый каллус. Анализ подтвердил факт трансформации: растительная ДНК несла Т-ДНК Ti-плазмиды. Кроме того, каллусная ткань производила опин, причем именно того типа, к которому относилась взятая в эксперимент Ti-плазмида. Конечно, это был успех, хотя и довольно скромный в количественном отношении.

Вскоре метод был усовершенствован. В смесь протопластов табака с препаратом ДНК Ti-плазмиды добавили ионы кальция и полимер полиэтиленгликоль. Таким путем частоту трансформации удалось повысить примерно в 10 раз. Правда, когда стали анализировать ДНК из трансформантов, то оказалось, что они содержат не целостную Т-ДНК, а лишь ее сегменты, более того, помимо Т-ДНК, в ДНК трансформантов находились и некоторые другие последовательности Ti-плазмиды, чего не наблюдалось при трансформации растений агробактериями. Эти факты означали, что механизм трансформации с помощью изолированной Ti-плазмиды иной, чем когда Ti переносится из агробактерий. Как бы то ни было, прямым переносом в клетки табака удалось ввести не только Ti-плазмиды, но и некоторые гибридные плазмиды, сконструированные на основе векторов, близких к уже знакомой нам pBR322. Такие векторы, как мы помним, не могут самостоятельно существовать в агробактериях, а значит, нуждаются в "спасителе" - Ti-плазмиде. Оказалось, что подобные плазмиды можно прямо, без посредников, ввести в протопласты табака. Например, была сконструирована плазмида, в которой ген устойчивости к канамицину был подставлен под сильный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV). На среде с антибиотиками формировались колонии трансформантов. Некоторые из них затем удалось регенерировать в зрелые растения, содержащие в ядерной ДНК несколько копий чужеродного гена. Последующие генетические скрещивания подтвердили, что устойчивость к канамицину переносится через семена в потомство как один из хромосомных признаков.

Для трансформации протопластов с целью введения в них чужеродных генов используют как "голую" ДНК, так и ДНК, "упакованную" в различные образования, защищающие ее от разрушения. К ним относятся получаемые искусственно липосомы. Они представляют собой мельчайшие пузырьки, окруженные оболочкой, в состав которой входят модифицированные жирные кислоты и белки. Липосомные "пули", начиненные ДНК, легко захватываются клеткой, не воспринимающей их как что-то чужеродное, ведь по своему строению оболочка липосом напоминает клеточные мембраны. Перенести ДНК в протопласт можно и путем его слияния с бактериальным сферопластом. Отличие между протопластом и сферопластом в том, что если у первого полностью ободрана клеточная стенка, то на втором сохранились ее остатки. Если гибридной ДНК, содержащей в своем составе ген, который желательно перенести в растения, трансформировать целые бактерии, затем превратить их в сферопласты и смешать с растительными протопластами, то гибридная ДНК получает возможность перейти прямо из бактериальной клетки в растительную.

Разработаны и специальные приборы, с помощью которых можно шприцем ввести ДНК внутрь протопласта. Техника введения изолированной ДНК в растительные клетки продолжала между тем совершенствоваться. Инго Патрику с коллегами из Базельского биоцентра в Швейцарии разработали метод, получивший название электропорации. Через раствор, содержащий смесь протопластов и ДНК, пропускают высоковольтный разряд, делающий поры в мембране, окружающей содержимое протопласта. В эти поры входит плазмидная ДНК, встраивающаяся затем в геном протопласта. С помощью электропорации в растения были перенесены различные химерные гены антибиотикоустойчивости. Важно, что пробитые электротоком "дырки" в мембране не убивают протопласты и довольно скоро залечиваются, после чего протопласт нормально регенерирует.

Вообще-то следует заметить, что для двудольных растений путь прямого переноса "голой" или "укутанной" в липосомы ДНК имеет не такое уж большое значение, поскольку они неплохо, как мы видели, трансформируются, и более естественным для них путем - с помощью агробактерий. Зато для однодольных (в особенности до недавнего времени, когда была открыта принципиальная возможность использования агробактерий и в этом случае), прямой перенос ДНК рассматривался как единственный способ введения чужеродных генов.

Первым доказательством тому, что трансформация клеток злаковых с помощью изолированной ДНК возможна, стала работа Лёрца с соавторами, выполненная в лаборатории Шелла в 1985 году. Протопласты, полученные, хотя и с трудом, из суспензии клеток пшеницы или итальянского райграса, смешивали с плазмидой ДНК, содержащей химерный ген устойчивости к канамицину, и добавляли в систему уже знакомые нам компоненты, способствующие проникновению плазмиды внутрь протопласта - ионы кальция и полимер полиэтиленгликоль. Через несколько недель на селективной среде с канамицином появились устойчивые колонии. Во всех трансформированных клетках обнаруживался сам введенный ген и кодируемый им фермент НФТ. Эти результаты четко показали, что к однодольным, включая злаковые, можно применить те же методы прямого переноса ДНК, что и к двудольным. В принципе это так, однако, как мы знаем, протопласты из клеток однодольных, а зерновых в особенности, получать намного сложнее, чем двудольных, а главное, что из этих протопластов до сих пор лишь в отдельных случаях удается провести регенерацию целого растения. Обойтись без протопластов помогает метод, предложенный недавно все в той же лаборатории Дж. Шелла. Суть работы вот в чем.

У ржи в развивающихся цветочных побегах - тиллерах находятся так называемые археспоровые клетки, из них в развивающемся пыльцевом мешке в результате двух актов мейотического деления образуется пыльца. Особенностью археспоровых клеток является высокая проницаемость для крупных молекул, в том числе и для ДНК. Воспользовавшись этим свойством, ученые отобрали около 100 растений ржи и стали вводить в их тиллеры рекомбинантную ДНК плазмиды, в которой ген устойчивости к канамицину находится под контролем промотора, способного обеспечить транскрипцию чужого гена в растениях. Растения заражали за две недели до мейоза. В это время на тиллерах находится пять листочков, причем на уровне третьего листочка имеются соцветия, куда и делали укол. После введения ДНК тиллерам давали возможность созреть и образовать цветки, а затем подвергали перекрестному опылению, взяв пыльцу с другого, также зараженного тиллера. Образовавшиеся семена проращивали на среде с канамицином. Из 3000 таких семян в семи случаях образовались зеленые проростки, что указывает на их жизнеспособность в присутствии антибиотика. В остальных случаях проклюнувшиеся из семян проростки погибали из-за чувствительности к канамицину. Отобранная семерка была подвергнута биохимическому анализу, показавшему, что два проростка действительно содержат фермент, кодируемый геном устойчивости к канамицину, а в их ДНК имеется участок, сходный с ДНК гибридной плазмиды.

Обратим внимание, что сам по себе отбор растений по признаку устойчивости к канамицину не дает уверенности, что выросшие в присутствии антибиотика растения и вправду получены генно-инженерными методами, а не являются обычными мутантами. Действительно, пять из семи растений пришлось отбросить, так как они не соответствовали двум самым надежным критериям того, что трансформация действительно произошла; в их ДНК не удалось обнаружить участки, гомологичные использованной для трансформации плазмиде, и они не содержали ферментативной активности, кодируемой плазмидным геном. Конечно, описанный опыт - пока лишь скромный, хотя и обнадеживающий успех. Частота трансформации очень низка - меньше одной десятой процента. И все же открылась возможность переносить рекомбинантную ДНК в зерновые культуры, вводя ее прямо в ткани, дающие начало половым клеткам.

Еще один способ трансформации зерновых разработан на семенах пшеницы. О нем профессор Дж. Шелл рассказал на симпозиуме по генетической инженерии растений, состоявшемся в биологическом академгородке Пущино-на-Оке вблизи Москвы в октябре 1987 года. Известно, что эмбрионы могут выживать даже после продолжительного высушивания семян. Высушенные семена поглощают воду и восстанавливают свою структуру. Процесс этот происходит в несколько стадий. На первой из них, не позже чем через пять минут от начала замачивания семян, их мембрана становится проницаемой для таких крупных молекул, как ДНК. Если успеть доставить в указанный интервал времени рекомбинантную ДНК, то она пройдет через мембрану внутрь зародыша. Таким путем удалось перенести в пшеницу бактериальный ген устойчивости к канамицину. Введение генов в изолированные эмбрионы действительно очень перспективный путь трансформации зерновых - не только для пшеницы, но и для ячменя, риса, тритикале.

Рис. 30

Совсем недавно (впрочем, в генной инженерии растений все недавно) Т. Клейн и его коллеги из Корнуэльского университета в США предложили новый оригинальный прямой путь введения чужеродных генов в растения. С помощью миниатюрного ружья 22-го калибра они сумели выстрелить обернутыми в ДНК или РНК дробинками прямо в "сердце" растительной клетки - ее ядро. Оказалось, что микроскопические дробинки из вольфрама, покрытые пленкой раствора генетического материала, выстреливаемые со скоростью 400 метров в секунду, способны пробить стенку и мембрану любой клетки, оказавшейся на "линии огня", не убивая ее. Дробинки замачивали в капле раствора ДНК или РНК и как бы приклеивали к торцу цилиндрической нейлоновой пули. Взрыв пороха в специальном патроне вызывает движение поршня и пули по стволу ружья. В конце ствола помещается стальная пластинка, помогающая отделявшимся от пули дробинкам проскочить и попасть в мишень. В качестве мишени использовали небольшие кусочки ткани, срезанные с поверхности луковицы. Известно, что образующие эту ткань клетки лука отличаются крупным размером. С помощью такого приспособления ученые обстреляли растительные клетки дробинками, укутанными в РНК вируса табачной мозаики. Попав в клетки, эта РНК дала начало жизнеспособным вирусным частицам. Их обнаружили примерно у 35 процентов клеток, пробитых дробинками. Следующим шагом в этой работе была попытка переноса в растения ДНК гибридной плазмиды, содержащей ген устойчивости к хлорамфениколу. В некоторых клетках этот чужеродный бактериальный ген экспрессировался, направляя синтез фермента, инактивирующего антибиотик. Авторы этой работы сообщают, что им удалось добиться успеха и при обстреле более мелких клеток, способных к образованию каллусной ткани и регенерации. Сравнительная простота "метода дробовика" позволяет надеяться, что он сможет найти применение в различных генно-инженерных экспериментах, например, даст возможность вводить новые гены не только в ядро, но и в клеточные органеллы.

К сожалению, методы прямого переноса ДНК и для однодольных, и для двудольных культур не очень надежны: по не совсем ясным причинам введенные таким способом чужеродные гены часто подвергаются перестройкам и даже вовсе выбрасываются. Это снижает вероятность их наследования в потомстве. И все же, если нужно в лабораторных условиях быстро проверить способность какого-либо гена в принципе работать в растениях, прямые методы удобны, поскольку можно избежать хлопот, связанных с введением гена вначале в агробактерии, а лишь затем в растения.

За 2 - 3 года, прошедших со времени публикации первых работ, посвященных прямому переносу генов в растения, его эффективность удалось повысить в 1000 раз и даже более. Удалось также заглянуть и в глубины трансформированной клетки, понять, что внедрение чужеродной ДНК в растительную клетку происходит в первые сутки после ее проникновения в клетку. Гены стали напрямую вводить не только в клетки, но и в семена, пыльцу и даже целые растения. Так, бактериальный ген фермента, разрушающего пенициллин, и ген гормона роста человека оказались в семенах арабидопсиса. РНК вируса табачной мозаики табака с помощью электропорации ввели в мезофильные клетки табака, а микроинъекции химерных генов в сосудистую систему ржи позволили провести трансформацию проростков.

Каков бы ни был способ переноса генов в растения с целью получения их трансгенных форм, значимость всей работы будет определяться тем, насколько стабильно переданный признак закрепится в геноме. Специальные исследования стабильности наследования генов, введенных в состав Т-ДНК, были проведены на трансгенных растениях петунии, томата и табака. Они показали, что место встраивания Т-ДНК у разных трансформированных клеток порой не совпадает: встройка может происходить в различные участки одной и той же хромосомы, а может и в разные. Независимо от этого Т-ДНК наследовалась как менделирующий признак, причем характер наследования менялся в зависимости от того, сколько копий Т-ДНК содержали клетки растения. Отмечено, между прочим, что перенос генов из промежуточного вектора в составе коинтеграта (а не через бинарную систему) ведет к включению в растительный геном меньшего числа копий Т-ДНК, а это облегчает последующее изучение их локализации и стабильности.

Иногда полезно разделить во времени процесс формирования устойчивого к антибиотику каллуса и регенерацию из него растений. Так добавление в среду для регенерации канамицина подавляет в некоторых случаях эмбриогенез каллусной ткани. Чтобы этого избежать, трансформированную ткань приходится довольно долго, даже до полугода, выращивать в среде без антибиотика, а лишь потом начинать регенерацию целого растения. Бывает и так, что листья и другие части трансгенных растений не синтезируют продукты введенных генов, а полученный из них каллус такой способностью обладает. Выходит, что само культивирование тканей in vitro может как бы включить в работу почему-то "задремавшие" чужеродные гены. Детально понять и научиться управлять всеми этими отклонениями - очень важная задача. Без ее решения трансгенные растения смогут преподнести "сюрпризы", которые затрудняют достижение конечной цели всей работы - создание принципиально новых устойчивых сортов растений методами генной инженерии.