Глава 5. Как научить гены работать?

Нам следовало бы удивляться только нашей способности - чему-нибудь еще удивляться.

Ларошфуко

В предыдущих частях книги не раз упоминались сигнальные элементы - регуляторы работы генов различных организмов. Без этих участков ДНК, которыми снабжены любые гены, записанная в них генетическая информация не сможет переписаться на молекулы мРНК, а следовательно, быть переведенной с языка нуклеотидов на аминокислотный язык белка. Сигнальные элементы - настоящие диспетчеры гена. Они определяют, когда, где и как ему работать. Они же дают "зеленый" или "красный" свет на функционирование чужих генов в различных организмах. Понять устройство и принципы работы таких элементов - значит, стать настоящим хозяином генов, взять в свои руки тончайшие и исключительно эффективные элементы регуляции их активности.

Как устроены сигнальные элементы растительных генов? Удивительно, но первые ответы на этот вопрос удалось получить при изучении вовсе не растений, а все тех же Ti-плазмид агробактерий. Именно их гены, передающиеся в растения в составе Т-ДНК, природа снабдила необходимыми регуляторными сигналами, без которых в трансформированных растительных клетках не могли бы синтезироваться ни опины, ни избыточные фитогормоны.

Рис. 22

Мы уже знаем, что в регуляции работы генов у различных организмов важную роль играют специфичные для прокариот (бактерий) и эукариот (грибов, растений, животных и человека) сигнальные элементы - промоторы. Они, подобно маякам, оповещают фермент РНК-полимеразу, синтезирующий мРНК, с какого места данного гена она должна начать свою работу. Промоторы прокариот и эукариот (в том числе и растений) различаются по строению. Отличаются и РНК-полимеразы, действующие в про- и эукариотах. Поэтому растительный фермент не распознает "маяк" прокариотического гена и не может транскрибировать его структурную часть, которая собственно и кодирует синтез белка. В этом и была причина неудачи экспериментов, в которых в растениях хотели заставить работать бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, внедрившиеся в Т-районы Ti-плазмид в составе транспозонов - бактериальные гены и не могли работать в растениях, ведь они попали в них вместе со своими собственными, прокариотическими промоторами, сигналы которых не распознаются растительной клеткой. Значит, нужно произвести замену: отделить структурную часть от промотора и подменить промотор на чужой - эукариотический, обманув тем самым растительную РНК-полимеразу. Вначале было решено посмотреть, нельзя ли под контролем эукариотического промотора добиться экспрессии (нормальной работы) в растениях различных, эукариотических же, генов. Для этого к одному из промоторов вируса SV40, вызывающего опухоли у обезьян, стали подшивать разные "чужеродные" для растений гены, взятые, например, у дрожжей или животных. Все эти попытки оказались неудачными; в растениях не обнаруживали ни белков - продуктов этих генов, ни соответствующих им молекул мРНК. Однако неудачный результат выявил еще одну важную истину - в растительных и животных клетках, несмотря на то, что и те и другие эукариоты, сигналы, позволяющие генетической информации передаваться с ДНК на РНК, отличаются. Следовательно, для того, чтобы чужеродный ген полноценно заработал в растительной клетке, его нужно снабдить распознаваемыми ею промоторами и другими сигнальными элементами. Но к тому времени, когда это стало ясно, 5 - 6 лет назад, имелись лишь отрывочные сведения о том, как устроены растительные гены и как они регулируются. Единственным геном, способным работать в растениях и достаточно изученным, оказался ген nos плазмиды Ti, кодирующий синтез нопалинсинтазы - того самого фермента, от которого зависит образование нопалина в клетках корончатых галлов.

Этот в сущности бактериальный ген оказался на редкость подходящим для генной инженерии растений. Он отлично приспособлен для работы в растениях. В бактериях ген nos "молчит": в них не образуется нопалинсинтаза, а значит, соответственно, и нопалин. Как мы уже знаем, бактерии используют опины в готовом виде, получая их с "фабрик" - корончатых галлов; чтобы клетки галлов могли производить опин, бактерия передает им нужный для этого ген в составе Т-района своей Ti-плазмиды. Надо сказать, что это производство очень эффективно, поскольку природа снабдила ген nos очень сильным, то есть активным, распознаваемым в клетках растений промотором, с которого может списаться много молекул мРНК, а с них уже насинтезироваться много молекул фермента. Наличие сильного растительного промотора и других сигнальных элементов, нужных для работы генов в растениях, стало главной причиной, почему ученые обратили самое пристальное внимание именно на ген nos и решили попробовать его промотор присоединить к какому-нибудь чужеродному для растений гену, чтобы заставить его работать в новом хозяине.

Первой об успешности такого подхода сообщала в январе 1983 года группа Шелла - ван Монтегю. Они присоединяли промотор гена nos к структурной части гена октопинсинтазы (ocs) из плазмиды Ti октопинового типа либо гена устойчивости к хлорамфениколу из транспозона Тп9. Химерные гены в составе Т-ДНК были введены в клетки растений. В трансформированных клетках, получивших первую либо вторую гибридную конструкцию, синтезировались соответственно октопинсинтаза либо фермент, инактивирующий хлорамфеникол. Следовательно, в обоих случаях нопалиновый промотор работал. В первом - обеспечил экспрессию лишенного собственного промотора гена ocs, во втором - впервые заставил работать в клетках растений совершенно новый для них бактериальный ген. Это был действительно успех, ознаменовавший подлинное рождение генной инженерии растений. Неудивительно поэтому, что подобного рода работы немедленно развернулись в нескольких лабораториях, занимающихся генной инженерией растений, за рубежом и у нас.

Исследователи решили взять реванш за неудавшуюся ранее попытку протащить в растения и заставить в них работать ген устойчивости к канамицину (kan), просто вставив Tn5 в плазмиду Ti. Теперь тактика была иная: сконструировали химерный ген, объединив регуляторные элементы гена nos со структурной частью гена kan и эту конструкцию ввели в Т-район Ti-плазмиды вместо нормального гена nos. Химерный ген заработал в трансформированных клетках табака и петунии, делая их устойчивыми к канамицину. Этот факт был практически одновременно установлен в лабораториях Дж. Шелла и М. ван Монтегю, М. Д. Чилтон, а также в исследованиях Роберта Фрели и его коллег из американской компании "Монсанто". Детали этих работ отличались, но во всех случаях в конструкцию химерных генов входили промотор и еще несколько сигнальных элементов гена nos.

Видимое доказательство переноса чужеродного гена - образование трансформированными клетками колоний на среде с канамицином - подкреплялось и биохимическими данными. Анализ ДНК трансформантов прямо выявил присутствие в ней химерного гена. Было также показано, что с этого гена в растениях синтезируется мРНК. В экстрактах трансформированных клеток была обнаружена активность НФТ - белка, кодируемого введенным геном. Все эти данные, вместе взятые, ясно показали, что устойчивость к канамицину является очень подходящим маркером для разработки методов трансформации растений.

Вскоре помимо табака и петунии удалось трансформировать томат, подсолнечник, сою, турнепс, морковь и некоторые другие двудольные растения. Продолжались поиски возможностей использовать новые промоторы, способные обеспечить экспрессию химерного гена в растениях даже более эффективно, чем нопалиновый промотор. Примечательным моментом в этой серии работ было также использование генов устойчивости к другим антибиотикам - это помогает ученым отрабатывать методы введения генов в различные растения. Например, клетки сои очень чувствительны к гигромицину В, но устойчивы к канамицину, значит, подбирая подходящие антибиотики, можно ввести в круг объектов генной инженерии все большее число видов растений.

Теперь, когда мы уже кое-что знаем об используемых для трансформации растений селективных маркерах, посмотрим, каким же условиям должен удовлетворять промотор, чтобы обеспечить работу введенных в растения чужеродных генов? Таких условий несколько. Об одном мы уже упоминали ранее - это сила промотора. Сильный промотор обеспечивает активную экспрессию, синтез многих молекул мРНК, а значит, и белка - продукта данного гена. Другое условие - экспериментатор должен иметь возможность по своему желанию регулировать работу подстроенных под промотор генов. Третье условие состоит в том, что промотор должен быть способным обеспечивать работу введенных генов именно в тех органах и тканях, где это будет наиболее целесообразно. Скажем, если ученый ставит своей целью усилить фотосинтезирующую активность растений и для этого вводит в них какой-то новый ген, то ясно, что работать он должен в листьях, обращенных к свету, а не в корнях. Точно также, если нужно улучшить качество запасного белка растения, накапливающегося в зернах, то вводимый ген надо заставить функционировать именно в зернах. Это свойство промоторов и генов называют органо-и тканеспецифичностью. Есть и еще одно условие - введенный ген должен найти свое место в слаженном "хоре" растительных генов, суметь правильно взаимодействовать с генами нового хозяина.

Посмотрим теперь, как эти условия удается выполнить на самом деле. Про сильные промоторы уже говорилось. Пока больше других генным инженерам растений подошли промоторы генов синтеза опинов из Ti-плазмид, в особенности нопалинового гена, а также пара промоторов, присутствующих в ДНК вируса CaMV. С их помощью различные чужеродные гены эффективно заработали в трансформированных клетках растений. Однако не всегда сильный - значит лучший. Бывают случаи, когда усиленная экспрессия какого-либо введенного гена ведет к нежелательной для клетки сверхпродукции кодируемого этим геном белка - она замедляет рост или даже гибнет.

Нужно, правда, отметить, что уровень экспрессии введенного гена даже под контролем сильного промотора может различаться от растения к растению. Многое зависит от того, в какое место растительного генома встроится новый ген. В генетике это явление известно как "эффект положения". Оно показывает, что экспрессия каждого гена определяется не только силой его промотора, но зависит и от окружающих ген соседних последовательностей нуклеотидов. По некоторым данным, вариабельность в экспрессии введенного гена у разных растений зависит от того, в каком числе копий внедрился новый ген в геном растений. Например, одиночные вставки гена устойчивости к канамицину приводят к более высокому уровню активности неомицинфосфотрансферазы, чем множественные. Несмотря на такие вариации, затрудняющие сравнение силы различных промоторов, удалось установить, что в среднем работа гена под контролем промотора вируса CaMV в десятки раз эффективнее, чем в случае использования промотора nos. Вирусный промотор, кроме того, оказался способным обеспечивать экспрессию генов млекопитающих: гена одного из половых гормонов человека, а также крысиного гена, кодирующего устойчивость клеток к сульфаниламидным препаратам.

Промоторы из Т-ДНК и растительных вирусов действительно неплохие, но разве нет у растений собственных, подходящих по многим признакам промоторов, чтобы каждый раз не "брать напрокат" то от бактерий, то от вирусов? Конечно, есть. Да только выделить растительный промотор, получить его в виде изолированного фрагмента ДНК очень непросто.

Как же выявить маленькие промоторные последовательности в громадном геноме растений? На помощь в решении этой задачи пришли рестриктазы и специальные векторы для отбора промоторов. Такие векторы содержат "обезглавленные" гены. В них сохранена кодирующая какой-либо фермент последовательность нуклеотидов, а промотор, без которого ген "молчит", отсутствует. Для того чтобы такой ген "заговорил", он должен быть присоединен к промоторной последовательности. Нарезанные рестриктазами сегменты растительного генома вставляют в участок вектора, примыкающий к "молчащему" гену, а гибридные молекулы трансформируют в растительные клетки. Обычно для отбора промоторов в качестве индикатора используют ген, кодирующий устойчивость к антибиотику. Если в каком-то из клонируемых сегментов ДНК растения имеется промотор, то присоединение такого сегмента к молчащему индикаторному гену заставит его "заговорить" - трансформированные клетки растения смогут расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком. Работа по отбору растительных промоторов и их практическому использованию в целях генной инженерии растений уже началась. Сильные промоторы обнаружены, например, у генов, кодирующих синтез так называемых запасных белков, накапливающихся в семенах. По-видимому, некоторые из таких промоторов действуют в определенных тканях растений, другие - лишь в ядре или только в органеллах - в хлоропластах или митохондриях. Ученые надеются, что это откроет возможности для избирательной экспрессии введенных генов в определенных частях целого растения.

Для целей генной инженерии оказалось важным, что промоторы даже совершенно различных видов растений могут быть близки между собой. Это сходство позволило, например, генам однодольных растений, переданным в двудольные, "прижиться" в новых хозяевах. Так, ген зеина - запасного белка кукурузы - "заработал" в клетках опухоли подсолнечника, ген пшеницы, кодирующий один из важных белков фотосинтеза - в нормальных табаке и петунии. Примечательно, что в этих растениях "пшеничный ген" сохранил свои характерные черты. Он функционировал только в клетках листьев, то есть органоспецифично, да к тому же не постоянно, а лишь при солнечном освещении. Можно привести и другие сходные примеры: гены запасного белка сои (конглицинина) и фасоли (фазеолина), будучи перенесенными в петунию, табак и подсолнечник, эффективно транскрибировались, но не во всех частях растений, а именно там, где и должно происходить накопление запасных белков, - в семенах. Ген фазеолина работал в семенах табака столь активно, что списывающаяся с него мРНК составила заметную долю суммарной мРНК семян. В других тканях трансгенных растений табака (листьях, проростках, каллусе) ген фазеолина экспрессировался в тысячу раз хуже.

До недавнего времени показателем активности какого-либо промотора в клетках растений служила его способность обеспечивать в них работу уже известных нам бактериальных генов, кодирующих устойчивость к канамицину или хлорамфениколу. Если в трансформированных клетках обнаруживали кодируемые этими генами ферменты, то это означало, что промотор подходящий, ген действительно работает. Однако определить активность подобных ферментов не слишком просто. Вот если бы в руках экспериментатора оказался такой индикатор, чтобы сразу, лишь взглянув на трансформированные клетки, ткани или даже на целое растение, можно было быть уверенным, что использованный промотор обеспечивает функционирование введенного гена. В общем нужен ген-репортер, который может сообщать ученым о своей работе в растениях. Решить эту задачу сумели почти одновременно, но по-разному профессор Д. Хелински и его коллеги из Калифорнийского университета в США и группа ученых из Сегедского научного центра в Венгрии и Кельнского института растениеводства в ФРГ, работающих под руководством Аладара Шалаи и Дж. Шелла. Обе группы исследователей попытались использовать в качестве репортеров такие гены, которые дают возможность растениям светиться в темноте. У кого могут быть взяты подобные гены? Правильно, у всем знакомого светлячка. А еще у бактерий из рода вибрионов, живущих в море. Такие бактерии обитают на теле некоторых глубоководных рыб, благодаря чему они светятся.

Рис. 23

Способность организмов к свечению (биолюминесценции) определяется тем, что у них есть органические соединения, называемые люциферинами, от латинского lucifer - светоносный. При переходе этих соединений из "возбужденной", окисленной формы в основное, неокисленное состояние происходит испускание света. Окисление люциферинов обеспечивается работой ферментов, называемых люциферазами. Хелински и его сотрудники соединили ген люциферазы с промотором одного из вирусов растений. Рекомбинантный ген ввели в составе промежуточного вектора в агробактерию, заразили ею клетки табака, а затем из них вырастили целое растение. Трансгенное растение полили раствором люциферина - и оно засветилось в темноте! Так генная инженерия зажгла в растениях первую лампочку, сигнализирующую о способности определенного участка вирусной ДНК обеспечивать экспрессию чужеродного гена.

А. Шалаи и Дж. Шелл решали сходную задачу своим путем. Они выделили из светящихся эмбрионов и соединили друг с другом два гена люциферазы, называемых luxA и luxB. Оба гена через агробактерию ввели в клетки табака, получили из них каллусную ткань и показали, что если кусочки ткани растения пропитать раствором соединений аналогичных люциферинам светлячков - эти ткани засветятся.

Подобные системы могут оказать неоценимую помощь при исследовании активности различных генов в растениях. Для этого ген-репортер нужно соединить с промоторным участком изучаемого гена и ввести его в клетку, из которой можно регенерировать целое растение. Ясно, что растение будет светиться только тогда и только при тех условиях, при которых в норме работает в растениях изучаемый ген. Первые результаты в этом направлении уже получены. Группа А. Шалаи и ряд американских ученых соединили гены люциферазы вибрионов с промотором генов фермента нитрогеназы бактерий из рода ризобий. О значении этого фермента для фиксации азота, происходящей в корневых клубеньках бобовых, речь еще впереди. Здесь же нам важно вот что: когда "химерные" гены luxAB под контролем промотора нитрогеназы ввели в хромосому ризобий, а сами бактерии - в корневые клубеньки сои, то клубеньки начали светиться, если растение испытывало потребность в азоте. Выходит, растения светом сигнализировали людям: "мы хотим есть!" Могли ли селекционеры о таком даже мечтать? Конечно, нет, ведь как ни велики возможности отдаленной гибридизации, но скрестить растение со светлячком или вибрионом ей абсолютно не под силу.

Ученые надеются, что уже в недалеком будущем "гены света" помогут понять "расписание" включения и выключения различных генов в процессе развития растения из зародыша. И еще одно, не менее важное применение "генов света" - с их помощью можно изучать гены не только растений, но и любых других организмов, включая человека. Подобная система фотодетекции в сотни раз более чувствительна и намного дешевле, чем использовавшиеся до сих пор методы изучения активности различных генов. Сообщается о попытках введения гена люциферазы в клетки дрожжей, грибов, дрозофилы, кролика, быка и даже обезьяны.

Имеется еще одна исключительно многообещающая возможность для изучения работы генов. Она основана на использовании бактериального фермента β-глюкуронизады. Он оказался очень стабилен в трансгенных растениях, а определить его довольно легко с помощью цветной реакции по окрашиванию растительных клеток, выращиваемых на специальной среде. О работе гена в данном случае сигнализирует не свет, а цвет - вполне надежный и чувствительный показатель.

Теперь исследователи научились не только обнаруживать промоторы и другие сигнальные элементы, но и регулировать их работу. Природным регулятором активности растительных генов является солнечный свет. Гены, чувствительные к такой регуляции, находятся как в ядрах растительных клеток, так и в ответственных за фотосинтез цитоплазматических органеллах - хлоропластах. К первым относится ген, кодирующий один из компонентов фермента с довольно трудным полным именем - рибулезобифосфаткарбоксилаза, сокращенно РУБИСКО. Этот компонент является так называемой малой субъединицей фермента. Еще один ген, чья работа регулируется светом, находится в хлоропластах. Он кодирует белок, входящий в состав хлорофилла - содержащегося в хлоропластах зеленого пигмента растений, поглощающего в процессе фотосинтеза энергию света и превращающего ее в энергию, необходимую для образования химических связей в различных органических соединениях, из которых состоят растения. Без света ни ген малой субъединицы РУБИСКО, ни ген белка хлорофилла работать не могут.

Изучение последовательностей ДНК, стоящих перед структурной частью таких генов, выявило еще один, кроме промотора, регуляторный элемент, необходимый для их экспрессии. Его называют энхансером, или усилителем. Он дек ствительно способен усиливать активность промотора, сделав ее светозависимой. Такие энхансеры работают в листьях, но "молчат" в корнях, то есть в тех частях растения, которым недоступен свет. Использование подобных усилителей дало возможность сконструировать еще один тип химерного гена устойчивости к канамицину. В трансформированных растениях табака работу такого гена можно было "включать" и "выключать" по желанию экспериментатора. Стоило в течение нескольких часов пооблучать растение ультрафиолетом, как введенный ген начинал активно работать. Если воздействие прекращалось, "замолкал" и ген - клетки трансгенного растения постепенно вновь становились чувствительными к антибиотику.

К регулируемым светом промоторам, способным активизироваться при взаимодействии с патогенами, относится промотор гена, кодирующего белок халконсинтетазу. Это ключевой фермент синтеза флавоноидов - особого класса вторичных метаболитов, имеющих у растений самые разнообразные функции. Например, они действуют в молодых проростках как УФ-протекторы, то есть защищают клетки от вредного действия ультрафиолетового облучения. У бобовых растений флавоноиды синтезируются в ответ на действие стрессовых факторов, к которым относится и грибная инфекция. Они же участвуют и в образовании клубеньков на корнях бобовых. В этом случае они выделяются из растений в почву и встретившись с ризобиевыми (не путать с ризогенными!) бактериями, активируют в них работу генов, ответственных за симбиоз бактерий с растениями, приводящий к формированию азотфиксирующих клубеньков. Словом, халконсинтетаза действительно играет очень важную роль в жизнедеятельности растений, и, видимо, поэтому природа создала тонкие механизмы, регулирующие работу гена, кодирующего синтез такого фермента. Оказалось, что в промоторной части этого гена находится район, содержащий повторяющийся дважды участок примерно из 50 пар нуклеотидов и энхансер, благодаря которым ген халконсинтетазы регулируется УФ-облучением. Чтобы этот ген работал в новых хозяевах столь же эффективно, как и в прежних, он должен быть перенесен вместе с прилегающими к нему кусочками ДНК, не нужными вроде бы для кодирования фермента, но зато "зорко следящими", чтобы его ген реагировал на изменения окружающей среды и поступающие в клетки растений биологические стимулы. Эти данные, конечно же, представляют не только теоретический интерес: дальнейшее детальное изучение механизмов регуляции работы растительных генов в различных хозяевах дает возможность сознательно конструировать трансгенные растения с новыми хозяйственно ценными признаками.

Помимо света, регулировать активность промоторов может и окружающая температура. У растений и животных известна целая группа генов, включающихся в работу, после того как организмы хотя бы час проведут при температуре, превышающей нормальный для них уровень. Такие получили название генов теплового шока. Дж. Шелл и его сотрудники "подшили" промотор гена теплового шока дрозофилы к структурной части бактериального гена устойчивости к антибиотику. Когда такой химерный ген ввели в растения, оказалось, что при повышенной температуре растительные клетки приобретали устойчивость к антибиотику, а при нормальной - утрачивали его. Вот вам еще одна возможность "включать" и "выключать" введенные в растения гены по своему усмотрению.

Круг растений, чьи гены попадают в поле зрения генных инженеров, все время расширяется. Дошло дело и до картофеля. С помощью его генов ученые стремятся ответить на очень существенный для понимания всей генно-инженерной работы с растениями вопрос. Он может быть сформулирован так: если в растение вводится новый ген, отвечающий за какой-то признак, а в растении уже имеется собственный подобный же ген, называемый резидентным (заметьте: гены-репортеры уже были, гены-диверсанты тоже были, теперь появились гены-резиденты), то как работа нового гена отразится на качественных и количественных характеристиках функционирования резидентного гена и наоборот?

Чтобы ответить на этот вопрос, Лотар Виллмитцер из института по изучению биологии генов в Западном Берлине начал всестороннее исследование гена картофеля, работающего и светозависимо, и органоспецифично, то есть только в зеленых частях растения - листьях и стеблях. Ген этот получил название ST-LS1. Для тех, кто хочет знать больше, объясним, откуда взялось такое обозначение. ST - это Solatium tuberosum - латинское название картофеля: LS -leaf и stem - по-английски - лист и стебель. Его выделили, включили в состав вектора на основе Ti-плазмиды и перенесли из агробактерий в клетки томата. После регенерации целых растений из трансформированных клеток в них начали изучать работу внесенного гена. Оказалось, что в новом хозяине ген экспрессировался только на свету и лишь в стеблях и листьях, но не в корнях и плодах, и только после того, как заработал аналогичный резидентный ген томата. Значит, качественных отличий в работе введенного гена и гена-резидента не произошло. И другое, что выявили работы с геном ST-LS1: новый хозяин сам по себе мало влияет на качество и количество работы введенного гена - картофельный ген функционировал в томатах ничуть не хуже, чем "дома".

Рис. 24

Изучение другого гена, кодирующего в картофеле основной запасной белок клубней пататин, показало, что его можно научить работать в листьях трансгенных растений табака. Для этого оказалось достаточным заменить в гене пататина небольшой участок ДНК, расположенный в регуляторной зоне, на подобный же по местоположению участок из гена ST-LS1, работающего в норме в листьях, но не в корнях. Это еще раз показало, что за способность генов функционировать в различных частях растения отвечают, помимо промоторов, и другие последовательности.

Все рассмотренные случаи доказывают, что работа своих, чужих ли генов в растениях (как, впрочем, и в других организмах) регулируется. Но регуляция, связанная с функционированием промоторов, или, научно выражаясь, регуляция на уровне транскрипции, является не единственным способом проконтролировать активность генов путем ее усиления или подавления. В конечном счете показателем уровня работы гена является количество кодируемого им продукта. А последнее зависит не только от того, сможет ли с гена списаться достаточное число молекул РНК (это зависит от силы промотора), но и от того, что произойдет с этой РНК сразу же после транскрипции и во время трансляции, то есть синтеза белковой цепочки на рибосомах.

Здесь уместно сказать несколько слов об одной характерной особенности эукариотических генов, в том числе и генов растений. Дело в том, что функционально образующая ген последовательность пар нуклеотидов не равноценна. Ее можно представить себе в виде линии, выложенной белыми и красными кирпичами. Белые кирпичи - это последовательности, кодирующие аминокислоты, входящие в состав белка. Красные кирпичи не кодируют аминокислоты и даже не переписываются в мРНК. Первые называют экзонами, вторые - нитронами. Экзонинтронное строение присуще всем эукариотическим генам, у бактерий и внеклеточных организмов - вирусов они встречаются только как исключение. Как же клетка различает, какие части ДНК переводить на аминокислотный язык белка, а какие нет, если РНК списывается со всего гена? Исследования, выполненные в различных лабораториях, в том числе и у нас в стране еще в начале 60-х годов Г. П. Георгиевым, показали, что у эукариот с генов списывается первоначально не мРНК, а лишь ее предшественник. Он представляет собой переписанную на РНК копию всего гена. Сравнительно недавно было установлено, что эта РНК-предшественник подвергается особому превращению, называемому созреванием или процессингом, в ходе которого из нее вырезаются все участки, списанные с интронов. Цепочка РНК распадается на отдельные сегменты, которые затем сшиваются между собой в том же порядке, в каком они находились в исходной цепочке, - образуется зрелая молекула мРНК, не содержащая ничего "лишнего". Процесс собирания сегментов РНК-предшественника в одну молекулу мРНК называют сплайсингом (этот английский термин в переводе означает "сшивание"). Теперь мРНК вроде бы готова перейти из ядра в цитоплазму и присоединиться к рибосомам, чтобы начать синтез белка. Да не тут-то было. Оказывается, что мРНК должна пройти еще два превращения. С одного конца молекулы будет "подшита" специальная "шапочка", защищающая мРНК от разрушения клеточными ферментами и помогающая узнать ее рибосомам, с другой - "хвост" - последовательность, состоящая из нескольких адениловых рибонуклеотидов (поли А). Второй из этих процессов называют полиаденилированием мРНК. Он зависит от присутствия на конце эукариотических генов уже знакомой нам шестерки ААТААА, служащей сигналом на полиаденилирование. Обе эти последовательности не транслируются, то есть они не представлены в структуре белка. В генах прокариот таких сигналов нет. Поэтому, когда какой-нибудь бактериальный ген хотят с помощью вектора перенести в растение, с тем чтобы он там нормально работал, его окружают двумя участками - специфичным для эукариот промотором и сигналом на полиаденилирование РНК. В некоторых векторах эти последовательности включены заранее, чтобы вставленный между ними ген сразу же был снабжен участками, сигналящими растительной клетке: "Я здесь и готов к работе".

Представим себе, что мы сделали все для того, чтобы оптимальным образом отрегулировать активность вводимого в растения гена. Теперь-то наконец можно быть уверенным, что перенесенная в растения генетическая информация будет списана и считана и образуется полноценный новый белок? В общем-то это так. И все же не обойтись без "но". Все белки образуются в цитоплазме, но затем их нужно доставить на место: одних - включить в клеточную мембрану, других -отправить в хлоропласты, третьих - в митохондрии и т. д. Чужеродному белку надо найти место в клетке, да еще такое, чтобы это принесло ей, а значит, и целому растению максимум пользы. Мы уже упоминали случаи органоспецифической экспрессии перенесенных генов, например фазеолина фасоли и конглицинина сои в семенах табака и петунии. Конечно, избирательная работа введенных генов в определенных частях растения уже как-то приближает кодируемые генами белки к нужному месту. Но существует еще и необходимость правильно пристроить новый белок в пределах каждой клетки данного органа.

Посмотрим, как это происходит на примере уже упоминавшегося выше гена, кодирующего малую субъединицу фермента РУБИСКО. Этот вовлеченный в процессы фотосинтеза фермент состоит из двух субъединиц - малой и большой. Первая, как мы уже знаем, кодируется ядерным геном, вторая - хлоропластным. Сборка целого фермента происходит в хлоропластах. Но как доставляется туда малая субъединица? Детальное изучение вопроса показало, что эта часть РУБИСКО синтезируется в цитоплазме клетки в виде предшественника, содержащего на конце так называемый транзитный (то есть временный) или транспортный пептид - коротенькую, но очень важную последовательность аминокислот, обеспечивающую транспорт белка-предшественника и ядра в хлоропласты. Во время такого перемещения или сразу по его завершении транзитный пептид отделяется от белка-предшественника, что ведет к появлению функционально активной малой субъединицы РУБИСКО в клеточных органеллах. Примечательно, что транспортные пептиды малой субъединицы РУБИСКО в общем сходны у различных, даже далеких видов растений. Это обстоятельство позволило предположить, что транспортный пептид может обеспечить направленную доставку в хлоропласт и других белков, в том числе и необычных для растений. Проверка показала, что это действительно так. Часть гена малой субъединицы РУБИСКО, кодирующая транспортный пептид, была присоединена к структурной части гена устойчивости к канамицину. Полученную химерную конструкцию с помощью Ti-плазмидного вектора перенесли в клетки табака. Анализ трансгенных растений обнаружил гибридный белок в хлоропластах листьев. Это очень важные в практическом отношении результаты, они показывают, каким путем можно доставлять в клеточные органеллы растений новые белки. К сожалению, в руках генных инженеров растений пока нет вектора, способного специфично доставлять чужеродные гены в органеллы (например, чтобы повысить эффективность фотосинтеза). Использование транспортных пептидов в роли "лоцманов", точно доставляющих белки в различные части растительной клетки, позволяет доставлять в органеллы не сами новые гены, а уже их готовые продукты.

Как мы видим, у генных инженеров теперь есть немало возможностей, чтобы перенести гены в растения и научить их работать в новом окружении.

Представим себе, что мы определили, какой ген хотим перенести в растение, сумели его изолировать, снабдить необходимыми сигналами и посадить на "повозку" - вектор. Теперь для успеха всей работы нужно знать способы введения гибридной ДНК в геном растительных клеток. По существу, этим можно и ограничиться, если речь идет лишь о переносе желаемого гена в растительные клетки или ткани и его экспрессии в них. Но ведь цель генной инженерии растений шире. Для того чтобы создать генно-инженерными методами новую форму, линию и тем более сорт, необходимо выполнить еще одно условие - иметь возможность регенерации трансформированных чужеродными ДНК клеток и тканей в зрелые трансгенные растения, способные стабильно передавать вновь полученный признак через семена потомству. Об этом и пойдет рассказ в следующей главе.