От переводчика

Серия "Outline Stadies in Biology", к которой принадлежит эта книга, предопределила ее основные особенности: краткость и популярность. Поэтому перед автором стояла трудная задача, особенно осложнившаяся бурным развитием биохимической генетики. Р. А. Вудс, по-видимому, избрал единственно верный путь: не претендуя на всеобъемлющее и систематическое изложение, он обращается к некоторым основополагающим теоретическим концепциям и иллюстрирует их наиболее элегантными экспериментальными работами, так что читатель, не вникая в частности, может уловить сам принцип генетического и молекулярно-биологического мышления. Отбор работ настолько удачен, а форма изложения настолько увлекательна, что даже исследователь, имеющий опыт работы в молекулярной биологии, с интересом прочтет некоторые страницы этой книги.

Особенно удачна 4-я глава, в которой Вудс описывает ход исследования, проведенного с ауксотрофными arg-штаммами Neurospora, мутантными по генам синтеза аргинина.

Большое достоинство книги состоит в том, что Вудс успел ввести в книгу немало самых свежих данных. Однако молекулярная биология развивается такими темпами, что за короткий срок, прошедший после написания книги, не только были получены новые значительные результаты, но и возникли принципиально новые направления в самом изучении клеточных функций.

Общепризнано, что сам характер молекулярной биологии в последние годы существенно изменился. На начальном этапе ученые (часто физики по образованию) выдвигали определенную гипотезу, а затем планировали соответствующий эксперимент, подтверждающий ее правильность. Так построены, например, работы Крика и соавторов по доказательству триплетности генетического кода, большинство ранних экспериментов по изучению механизма репликации, схема Жакоба и Моно индукции гена и соответствующие эксперименты и т. д. Позднее в молекулярную биологию пришли исследователи со специальным образованием, и арсенал экспериментальных подходов значительно расширился. Например, разработка методов получения препаратов нуклеиновых кислот с высокой удельной радиоактивностью in vitro, а также отпечатков гелей после электрофореза для гибридизации и секвенирования нуклеиновых кислот позволила установить перекрывание генов ∅х174 и ряда других вирусов, а также разорванное строение генов эукариот и множества других, совершенно непредсказуемых фактов. Не случайно в последние годы за разработку новых методов молекулярной биологии неоднократно присуждались Нобелевские премии.

Конечно, этот взгляд на развитие молекулярной биологии несколько утрирует различие между "теоретическим" и "феноменологическим" подходами, и все-таки работы, в которых эксперимент используется для подтверждения определенной гипотезы, стали появляться реже.

Первое, о чем хотелось бы рассказать в предисловии, - новый важный шаг в изучении биохимической генетики клетки: от экспериментов, направленных на изучение функционирования имеющегося в клетке генетического материала, стало возможным перейти к введению в клетки чужеродных генов и изучению их активности. Вначале это было осуществлено на прокариотических клетках. В главе 6 книги описано, как получают рекомбинантные молекулы ДНК и как их вводят в клетки E. coli. Теперь аналогичная система уже разработана и для низших эукариот - дрожжей. При работе с дрожжевыми клетками в качестве векторов используют производные криптической (не имеющей фенотипического выражения) плазмиды дрожжей - так называемой двухмикронной плазмиды. Другой тип векторов содержит клонированные участки хромосом дрожжей, в которых начинается их репликация; оказалось, что они, подобно плазмидам, способны на протяжении многих поколений автономно реплицироваться в дрожжевой клетке. Очевидно, что с помощью таких векторов можно прямо получать в клонированном виде гены метаболизма дрожжей. Например, если взять ауксотрофные клетки, не способные расти на среде без лейцина, и трансформировать их векторной ДНК, сшитой с беспорядочными фрагментами хромосомной ДНК дрожжей, то небольшая часть клеток приобретет способность расти на минимальной среде. Эти клетки будут содержать плазмиды с генами, ответственными за синтез лейцина. Теперь можно выделить в чистом виде достаточное количество ДНК этих генов в виде рекомбинантных плазмид, выявить функционально важные участки, отвечающие за начало и конец транскрипции, индукцию и (или) репрессию и эффективную трансляцию, расшифровать последовательность. Можно пойти по другому пути: исследовать взаимодействие клонированных генов с клеточным геномом, в частности их рекомбинацию или регуляторные механизмы. Наконец, третье направление исследований имеет очень важное прикладное значение. Его цель - получить с помощью дрожжевых клеток достаточное количество белкового продукта клонированных генов других эукариот в тех случаях, когда по тем или иным причинам невозможно получить этот белок при клонировании гена в E. coli.

Работы по трансформации клеток высших эукариот (главным образом растений) начались лет пятнадцать назад, но они вызывали общий скептицизм: не была достаточно разработана генетика клеточных культур, не было четких контролей реверсии мутантов и способа проверки генетической природы трансформации, и, конечно, не было известно способов выделения ДНК отдельных генов. В настоящее время ситуация кардинально изменилась.

Наибольшее распространение в опытах по трансформации клеток высших эукариот получили культуры клеток животных, не способные превращать тимидин в ТМР (и затем в ТТР). Такие мутантные клетки обозначаются ТК^-, так как в них нарушен синтез фермента тимидинкиназы. Ген тимидинкиназы содержится в геноме вируса герпеса. Он был очищен и размножен путем клонирования в бактериальных клетках. Наконец, были разработаны методы введения ДНК в ТК^--клетки путем добавления в среду суспензии фосфата кальция или путем прямой инъекции ДНК в ядра с помощью микроманипулятора. Если теперь ввести в среду ингибиторы синтеза ТТР de novo, то ТК^--клетки погибают, а трансформированные клетки растут благодаря использованию тимидина, который также содержится в среде. Изучение генома трансформированных клеток показало, что введенная ДНК гена ТК рекомбинирует с ДНК клетки-хозяина, причем в рекомбинацию вступает и любая другая ДНК, которая была введена в клетки одновременно с ней. Таким образом, мутация гена ТК и возврат к дикому фенотипу служат просто маркером тех клеток, в геном которых встроилась чужеродная ДНК.

Существует и другой способ введения ДНК в клетки высших эукариот. Для этого используются векторы на основе вирусов эукариотических клеток, прежде всего вируса SV-40. В этом случае нет нужды в генетическом маркировании трансформантов, так как заразить можно практически все клетки в культуре. Трудность состоит в том, что из небольшой молекулы SV-40 нельзя удалить сколько-нибудь протяженный участок, не нарушив при этом функциональной активности вируса. Чтобы решить эту проблему, используют вирус-помощник, гены которого могут комплементировать нарушенные функции вектора, и клетки заражают одновременно двумя вирусами или используют уже трансформированные клетки, в геном которых включился вирус-помощник.

Все эти приемы позволяют получить клетки, в которых чужеродные гены сохраняются и реплицируются на протяжении многих поколений. Разработана еще одна экспериментальная система, которая позволяет изучать экспрессию клонированных генов in vivo, хотя в ней введенная ДНК не реплицируется. Речь идет о введении препаратов кольцевых ДНК в ядра ооцитов амфибий и рыб с помощью микроманипулятора. В огромных ядрах этих клеток имеется большой избыток свободных белков хроматина и РНК-полимеразы. При введении ДНК вместе с радиоактивными предшественниками РНК начинается интенсивный синтез продуктов введенного гена. Этот введенный ген можно различным образом модифицировать, удаляя из него определенные участки, важные для регуляции. Такая работа была проделана в лаборатории М. Бернстила (Швейцария), изучавшего транскрипцию генов тРНК и генов основных белков хромосом - гистонов, и в лаборатории Д. Брауна (США), где исследовали работу генов 5S-PHK, входящей в состав рибосом. Полученные данные вместе с результатами исследований многих других лабораторий, работавших с другими генами, позволили выявить участки, ответственные за правильную транскрипцию генов у эукариот.

Оказалось, что у эукариот промоторы и соответствующие регуляторные участки для разных РИК-полимераз совершенно различны. Дело в том, что в клетках эукариот имеются три РНК-полимеразы: I, II и III. Первая отвечает за синтез всех рибосомных РНК, кроме 5S-PHK; вторая - за считывание всех структурных генов; РНК-полимераза III синтезирует 5S-PHK и все тРНК. Оказалось, что РНК-полимераза III для проявления активности вообще не нуждается ни в каких последовательностях вне транскрибируемого гена. В гене тРНК можно убрать все нуклеотиды, прилегающие к обоим концам гена, и это приведет лишь к смещению начальных и конечных точек транскрипции, но практически не изменит ее эффективности. Промотор одного из генов тРНК (участок, ответственный за связывание РНК-полимеразы III и считывание тРНК) состоит из двух частей: нуклеотидов 13 - 20 и 51 - 64 (весь ген содержит 83 пары оснований). Даже последовательность внутри гена между этими двумя участками не влияет на транскрипцию; существенно только расстояние между ними. Например, эту центральную часть гена можно заменить на чужеродную синтезированную последовательность равной длины. Конечно, продукт такого химерного гена не может выполнять функцию тРНК.

Сходная ситуация наблюдается и при считывании гена 5S-PHK: он содержит все сигналы, необходимые для эффективной транскрипции. В этом случае промотор находится примерно в середине гена длиной 120 пар оснований. Для эффективной транскрипции (в отличие от генов тРНК) необходим специфический белок, присутствующий в ооцитах. До сих пор не совсем понятно, каким образом эффективная инициация транскрипции РНК-полимеразой III регулируется последовательностями, лежащими на расстоянии нескольких десятков пар оснований впереди самого участка инициации. Видимо, существуют два типа промоторов для РНК-полимеразы III: одни, подобно гену тРНК, не требуют дополнительных белковых факторов, другие, совершенно негомологичные по последовательности, нуждаются в них, как, например, ген 5S-PHK.

Механизм регуляции активности РНК-полимеразы II в большей степени напоминает прокариотические системы. На расстоянии 25 - 30 нуклеотидов перед точкой начала транскрипции расположена так называемая последовательность Голдберга-Хогнесса. В "усредненном" виде она выглядит так: ТАТААА, но в разных генах она может несколько различаться. Аналогичная последовательность была раньше обнаружена примерно в том же положении относительно начала транскрипции мРНК и в прокариотических промоторах; там она называется последовательностью Прибнова. Последовательность Голдберга-Хогнесса определяет точку начала считывания мРНК, но практически не влияет на эффективность транскрипции, поэтому ее иногда называют селектором. На расстоянии примерно 100 - 300 пар от начала транскрипции располагается второй функционально важный участок, так называемый модулятор. Он определяет эффективность транскрипции, но не в состоянии правильно указать, где именно должен начаться синтез мРНК. Определяющая роль модулятора в активации РНК-полимеразы II доказывается тем, что его можно пересадить от одного гена в соответствующий участок перед началом другого гена, и этот последний будет работать. Гипотеза о системе активации РНК-полимеразы II, состоящей из селектора и модулятора, была предложена в результате изучения транскрипции генов гистонов, введенных в ооциты, генов вируса животных клеток SV-40 и некоторых других генов.

Хотя в целом не вызывает сомнения, что функциональные элементы, ответственные за правильное начало транскрипции, с одной стороны, и ее эффективность - с другой, разобщены, по мере изучения новых генов ситуация усложняется. Во-первых, в промоторной области иногда наблюдаются существенные отклонения от "канонической" последовательности Голдберга-Хогнесса; во-вторых, расстояние между селектором и модулятором сильно колеблется; в-третьих, между последовательностями различных модуляторов пока не обнаруживается гомологии.

Что касается РНК-полимеразы I, исследование факторов и генетических элементов, ответственных за ее активность, только начинается.

Если изучение эукариотических промоторов и регуляции транскрипции вполне укладывается в логику молекулярно-биологических исследований, то еще одна проблема, о которой следует рассказать и над которой работают десятки лабораторий во всем мире, возникла довольно неожиданно. Речь идет о так называемых прыгающих генах, или подвижных генетических элементах, которые широко распространены у многих, а может быть, у всех организмов и самым существенным образом влияют на работу генома.

Подвижные генетические элементы были обнаружены в геноме кукурузы генетическими методами довольно давно в классических работах Б. Мак-Клинток. Она показала, что активность гена, контролирующего окраску зерен, зависит от регуляторного элемента DS, расположенного в непосредственной близости от гена окраски: при таком положении зерна бесцветны. Ген DS способен перемещаться в геноме; при этом активность гена окраски перестает подавляться. Ген DS может занимать различные места в геноме и подавлять при этом активность близлежащих генов.

Позднее были открыты транспозоны - генетические элементы E. coli, способные к перемещению в геноме и инактивации или, наоборот, активации тех генов, рядом с которыми они располагаются. Транспозоны могут также внедряться внутрь генов, приводя к их инактивации.

Революция в молекулярной биологии, вызванная появлением генной инженерии, привела к открытию подвижных генетических элементов и у других организмов.

Многие исследователи занялись выделением генов, ответственных за синтез наиболее "богатых" мРНК, т. е. мРНК, представленных в клетке большим числом молекул. Неожиданно было установлено, что у самых изученных в генетическом отношении эукариот - мухи дрозофилы и дрожжей - большое количество мРНК считывается не с уникальных генов, как ожидалось, а с генов, повторяющихся в геноме десятки и сотни раз. Эти гены были клонированы и изучены; оказалось, что по многим свойствам они очень напоминают те, старые прыгающие гены кукурузы. Следует отметить, что прыгающие гены дрозофилы были открыты и изучены в лабораториях Г. П. Георгиева и В. А. Гвоздева в Институтах молекулярной биологии и молекулярной генетики АН СССР.

Выяснилось, что в принципе прыгающие элементы дрожжей и дрозофилы устроены одинаково и напоминают транспозоны бактерий. По краям в них расположены одинаково ориентированные повторяющиеся последовательности длиной в несколько сот пар оснований, которые обладают любопытным свойством: в зависимости от направления считывания они работают как промоторы или как терминаторы транскрипции. Между ними располагается последовательность, которая считывается в виде РНК. Хотя эта РНК полиаденилируется, т. е. к ее 3'- концу присоединяется последовательность polyA, до сих пор не ясно, является ли она собственно информационной РНК, т. е. кодирует ли какой-нибудь белок, или сама по себе играет регуляторную роль. Как бы то ни было, прыгающие гены, полученные путем клонирования, обладают свойствами, предсказанными на основании генетического анализа: они характеризуются непостоянным расположением в геноме (в популяции и в ряду поколений); они способны инактивировать ген, рядом с которым они находятся; их действие контролируется генетически - например, действие прыгающих генов дрожжей зависит от полового типа клеток. В настоящее время усилия исследователей сосредоточены на изучении механизма перескоков и инактивации соседних генов, а также на выяснении возможной биологической функции подвижных генетических элементов.

Относительно функции прыгающих генов существует крайняя точка зрения, согласно которой у них нет функции. Ф. Крик назвал их "эгоистическими" генами и предположил, что их главное свойство состоит в способности на протяжении длительного времени сохраняться в геноме, не влияя существенным образом на жизнеспособность организма. Косвенным подтверждением такого взгляда служат определенные эндогенные вирусы, которые, видимо, клетке не нужны, но на протяжении длительного времени сохраняются в геноме и главное сходны по строению с прыгающими генами. По всей вероятности, в недалеком будущем мы узнаем много нового о подвижных генетических элементах. Как бы то ни было, их открытие дает совершенно новое представление об организации генетического материала, и в частности о его возможных перестройках.

Следует отметить, что в последнее время появились сообщения о клонировании и изучении прыгающих генов кукурузы, тех самых, которые были впервые открыты в лаборатории Мак-Клинток.

К сожалению, в библиографии к книге Вудса мало книг, переведенных на русский язык, поэтому имеет смысл указать хотя бы следующие наиболее фундаментальные издания:

1. Гершкович И. Генетика. Пер. с англ. - М.: Наука, 1968. - Один из лучших учебников генетики на русском языке.

2. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. Пер. с англ. - М.: Мир, 1978. - Блестяще написанная краткая энциклопедия современной молекулярной биологии, доступная без специальной подготовки.

А. Колчинский