IV.3. Изучение биохимических различий между нормальной и мутантными формами - один из возможных путей анализа проявления моногенных различий и изучения неаллельных взаимодействий

Генные мутации, изменяющие последовательность оснований в молекуле ДНК за счет замен, выпадений или вставок одной или многих пар оснований, приводят к изменению аминокислотной последовательности в ферменте, белке. Это обусловливает потерю или снижение активности фермента. Поэтому одним из возможных подходов, позволяющих понять причину наследственных различий между формами, является биохимический анализ генных продуктов у мутанта и в норме. Такой анализ впервые был проведен Ингремом (1957) на аномальном гемоглобине людей, страдающих серповидноклеточной анемией, контролируемой одним геном (по данным анализа родословных). Исследование проводили методами электрофореза и "отпечатков пальцев". Последний заключается в том, что полипептидные цепи расщепляют на мелкие пептиды трипсином или хемотрипсином. Смесь этих пептидов разделяют на бумаге сначала с помощью электрофореза, затем хроматографически. Таким образом получают пептидные карты, на которых в определенном порядке располагаются пятна, соответствующие отдельным пептидам. Пятна на пептидных картах гемоглобина А (НbА) здоровых людей и гемоглобина S (HbS) больных серповидноклеточной анемией практически идентичны, за одним исключением: в НbА присутствует пептид, которого нет в гемоглобине больных HbS (рис. IV. 1, IV.2). Оба пептида выделили и определили в них аминокислотные последовательности. Оказалось, что в HbS в шестом положении от N-конца присутствует валин, в то время как в НЬА там же стоит глутаминовая кислота. Оба белка находятся в β-цепи. Гемоглобин-первый генетически контролируемый вариант белка, у которого была расшифрована структура.

Рис. IV.I. Пептидные карты гемоглобинов А и S. Цифрами обозначены номера пептидов

На основе анализа наследственных дефектов, контролируемых моногенно, с использованием молекулярно-генетических и биохимических методов определяют, какой белок дефектен. Это установлено для 2000 наследственных заболеваний человека, для множества мутаций у животных, растений и микроорганизмов.

Рис. IV.2. Электрофореграммы гемоглобинов здорового, больного и гетерозиготного носителя серповидноклеточной анемии

Практически любой метаболический путь в организме находится под контролем множества генов, каждый из которых определяет протекание одного из его этапов. Поэтому эффекты взаимодействия неаллельных генов, выявляющиеся в виде соответствующих расщеплений при гибридологическом анализе, изучают на уровне продуктов действия этих генов, на уровне биохимических нарушений метаболизма.

Инактивация фермента блокирует какой-либо этап метаболизма, что, как правило, сопровождается накоплением субстрата, с которым не может взаимодействовать инактивированный фермент (или этот субстрат направляется на другой метаболический путь). Таким образом, сбалансированный, отрегулированный метаболизм нормальных клеток нарушается. У мутантов накапливаются в больших количествах определенные метаболиты или, наоборот, их количество резко уменьшается. Именно эта особенность изменения метаболизма используется для анализа биохимических механизмов неаллельных взаимодействий.