VII.2. Определение группы сцепления с помощью метода гибридизации соматических клеток

Определение группы сцепления традиционными методами гибридизации или анализа родословных на ряде объектов, например на млекопитающих и человеке, сопряжено с большими трудностями и ограничениями. Обычно для этого использовали данные о совместном наследовании какого-либо признака и аномальных хромосом в семьях. Выявление совместной передачи признака и аномальной хромосомы служило указанием на локализацию гена в аномальной хромосоме. Длительность времени генерации и малая плодовитость млекопитающих и, в особенности, человека объясняют малую интенсивность и большую трудоемкость подобной работы.

Введение новых методов в генетический анализ, в частности метода гибридизации соматических клеток, открыло новые возможности локализации генов, прежде всего у человека.

Используя агенты, стимулирующие слияние клеток в культуре (вирус Сендай, инактивированный ультрафиолетом), можно гибридизовать соматические клетки, в том числе клетки разных видов: мышь×человек, мышь×крыса, человек×китайский хомячок и пр. При этом образуются клетки, содержащие ядра обоих видов - гетерокарионы. Они либо погибают, либо, просуществовав некоторое время в культуре, образуют одноядерные гибридные клетки - синкарионы. В гибридных клетках при их размножении происходит случайная утрата части хромосом, причем теряются, как правило, хромосомы одного из видов. Например, в гибридах "крыса×человек" - крысиные, в гибридах "мышь×человек" - преимущественно человеческие. Клеточная линия, хромосомы которой утрачиваются, называется донорной, другая - реципиентной. В результате гибридные клетки содержат более или менее полный набор мыши и различные (в среднем 5-7) хромосомы человека, причем в разных клонах - разные.

Гибридные клетки, используемые для локализации генов, могут быть выделены двумя способами.

1. Неселективное выделение из культур, где гибридных клеток больше, чем родительских. При этом способе получают очень большое число независимых гибридных клеток для создания небольшого числа гибридных клонов, каждый из которых может иметь разные наборы человеческих хромосом. Этот метод мало производителен и очень трудоемок, так как многие гибридные клетки, выделяемые для получения клонов, часто оказываются нежизнеспособными. Кроме того, при этом выделяются клоны со случайными маркерами.
2. Селективное выделение заключается в культивировании смеси клеток, содержащих как родительские, так и гибридные клетки на среде, на которой растут только гибридные клетки. Когда в культуре остаются только гибридные клетки, клонируют отдельно некоторые из них. При этом способе используются ауксотроф-ные мутанты, дефектные по синтезу определенного метаболита, который является селективным веществом (рис. VII.3).

Рис. VI 1.3. Метод селективного выделения гибридных клеток при соматической гибридизации. ГФРТ - фосфорибозил-гипоксантин-трансфераза, ТК - тими-динкиназа. 1 - хромосомы человека, 2 - хромосомы мыши

Использование ауксотрофных мутантов при соматической гибридизации облегчает выделение определенных гибридов. Например, при слиянии клеток мыши, дефектных по аденину, с клетками человека, дефектными по пролину, возникают прототрофные гибриды, которые растут на среде, лишенной обеих аминокислот, в то время как родительские клетки обоих видов на этой среде погибают. С помощью селективных сред выделены мутанты, требующие для своего роста добавления в среду аминокислот, нуклеоти-дов, углеводов и т. д., а также температурно-чувствительные и др.

Если мышиные клетки ауксотрофны по какому-либо фактору роста, а человеческие - прототрофны по этому фактору, то рост гибридных клеток на селективной среде осуществляется только за счет работы гена, локализованного в какой-то хромосоме человека в данном клоне. Ферменты мыши и человека, контролируемые соответствующими гомеологичными аллелями, различаются с помощью метода электрофореза. Сопоставляя наличие определенных хромосом человека в разных клонах и определенных ферментов, обеспечивающих рост гибридных клеток, можно выявить, в какой из хромосом человека локализован этот ген. Это так называемый метод панельного анализа гибридных клеток, представленный в задаче № VII.2.

На основании характеристики трех гибридных клонов определить, в каких хромосомах человека локализованы гены, контролирующие активность четырех ферментов - а, b, с и d.

Характеристика гибридных клонов I, II и III:

+ наличие фермента и хромосомы, - отсутствие фермента и хромосомы.

Поскольку ферменты a, b и d есть у всех трех клонов, в которых присутствует одна общая хромосома человека - 3, можно сделать вывод, что гены, контролирующие синтез этих ферментов, локализованы в третьей хромосоме. Фермент с присутствует только в клоне III, который отличается от клонов I и II наличием 12-й хромосомы человека. Очевидно, ген, контролирующий этот фермент, локализован в 12-й хромосоме.

Гены, контролирующие активность ферментов a, b и d, локализованы в 3-ей, ген, контролирующий активность фермента с, в 12 хромосоме человека.

Особенно ценны для такого анализа клоны, содержащие лишь одну из хромосом человека - наличие того или иного человеческого фермента в этом случае однозначно свидетельствует о локализации соответствующих генов в этой хромосоме человека.

Сейчас известно несколько различных селективных маркеров и соответствующих селективных сред, используемых для выделения гибридных клеток (человек×мышь) и (человек×китайский хомячок), в которых сохраняются определенные хромосомы человека - X, 12, 16, 17. Список этот постоянно увеличивается.

Если каких-то два гена приписаны одной и той же хромосоме с помощью данного метода, то они называются синтенными, т. е. принадлежащими одной синтенной группе, которая соответствует группе сцепления; все остальные гены, которые по данным родословных с ними сцеплены, относят к той же группе.

При анализе различных маркеров человека в большом числе разных клонов можно обнаружить, что некоторые маркеры всегда встречаются и утрачиваются вместе, при этом идентифицируется одна хромосома, что указывает на их принадлежность этой хромосоме. На этом основан другой метод локализации генов в группе сцепления с помощью гибридов соматических клеток.

Например, если в гибриде гены А, В, С и М принадлежат человеку, а гены D, К и О - мыши, причем гибридные клетки растут только при наличии генов В и К (селективные маркеры), то потеря хромосом человека, например с генами А и М, может привести к появлению гибридных клеток с генотипом если потеряется также одна из гомологичных хромосом с геном-селектором (ВС), то появятся клетки с генотипом Изучив кариотипы этих клеток и их генотипы по неселективным маркерам А и М можно сделать следующие выводы: гены А и М не синтенны с геном-селектором В, так как исчезновение генов А и М не привело к исчезновению гена В - он нормально экспрессируется. Гены В и С синтенны, так как они проявляются в гибридных клетках, где присутствует лишь одна хромосома человека. Цитологически, на основе дифференциального окрашивания, определяют, какая хромосома человека сохраняется в гибриде, и таким образом привязывают к ней гены В и С.

На основе метода гибридизации соматических клеток уже определены все синтенные группы человека (соответственно все группы сцепления); он успешно применяется для определения групп сцепления на мышах, крысах, китайском хомячке и др.