IX.4. Принципы идентификации, выделения и анализа гена с помощью методов генетической инженерии

Для выделения и идентификации генов используют несколько методов.

Идентификация гена может быть проведена по продукту гена, например, по мРНК, которая используется для поиска соответствующего гена в клонотеке генов путем блот-гибридизации (см. рис. VIII.9). Так были выделены и клонированы рибосомные гены, гены малой ядерной РНК, тРНК и др.

Если известна аминокислотная последовательность белка, то для выделения соответствующего гена можно использовать в качестве молекулярного зонда синтезированный in vitro олигонуклеотид (метод олигонуклеотидных зондов). На основе кодового словаря синтезируют набор олигонуклеотидов, которые могут кодировать 5-10 аминокислот, входящих в исследуемый полипептид, и их применяют в качестве зонда.

После выделения гена изучают его структуру с помощью рестрикционного картирования (см. гл. VIII) и оцределяют нуклеотидную последовательность.

Для анализа структурной и функциональной организации генов эукариот (экзоны, интроны, сайты инициации и терминации) помимо методов генетической инженерии используют также электронно-микроскопический анализ гибридных молекул РНК-ДНК (гетеродуплексный анализ). Поскольку гены эукариот имеют прерывистое строение: в них кодирующие области (экзоны) прерываются вставочными последовательностями (нитронами), которые отсутствуют в зрелой мРНК, на препаратах гибридизованных РНК-ДНК с помощью электронной микроскопии можно определять положение интронов.

Рис. IX.8. Выявление экзонно-интронного строения гена эукариот с помощью гетеродуплексного анализа по R-петлям, а, б

Если РНК гибридизуют с одноцепочечной ДНК, то гибридные двухцепочечные комплементарные области имеют большую толщину, чем одноцепочечные, а некомплементарные последовательности интронных областей ДНК образуют петли одноцепочечной ДНК, длина и размер которых определяют локализацию и размер интрона внутри гена (рис. IX.8, а).

Если РНК гибридизуют с двухцепочечной ДНК, то одна из цепей ДНК образует петли одноцепочечной ДНК (R-петли) в местах, где происходит замена одной из цепей ДНК-дуплекса на комплементарную ей РНК. Промежуточная последовательность, неспособная спариваться с РНК, образует более толстую петлю двухцепочечной ДНК, выступающую из области гибридизации РНК-ДНК. Эта петля и соответствует интрону (рис. IX.8, б). Электронно-микроскопическое картирование имеет разрешающую способность порядка 10-50 п. н.

Прерывистость строения генов эукариот и положение экзонов и интронов в нем можно определять, сопоставляя нуклеотидные последовательности зрелой мРНК (или кДНК) с геномной копией.

Анализ различных мутантов, полученных с помощью индуцированного мутагенеза или спонтанно и затрагивающих разные участки гена, позволяет определять функциональную значимость каждого его участка.

Подробное описание генно-инженерных методов дается в ряде методических пособий, что избавляет нас от необходимости их изложения.