Глава II. Тонкая структура гена (А. А. Прозоров)
1. Развитие понятия "ген" в генетике многоклеточных организмов
Термин "ген" существует более 50 лет. Эквивалентный термин "фактор" был введен Г. Менделем в начале 60-х годов прошлого века. За столетнюю историю содержание термина несколько раз менялось; изменения были связаны с введением новых моделей, методик, развитием генетики и смежных областей биологии. Небезынтересно проследить общую тенденцию этих изменений.
Мендель, как известно, ставил опыты на горохе, изучая поведение при скрещивании таких морфологических признаков, как форма и окраска семян и цветков. На основании полученных количественных закономерностей был сделан вывод о том, что изученные признаки определяются какими-то задатками, находящимися в половых клетках. Эти задатки он назвал факторами. По мнению Менделя, в гибридном организме отцовский и материнский факторы, влияющие на один тот же признак, взаимодействуют таким образом, что один из них является преобладающим, доминирующим и совершенно затемняет влияние второго. Например, растение, полученное от скрещивания особей с желтыми и зелеными семенами, имеет желтые семена без всяких промежуточных оттенков к зеленому. Однако в потомстве гибрида вновь возникают особи, обладающие подавленным, рецессивным признаком. Таким образом, фактор данного признака отнюдь не уничтожается, а сохраняется и может выявиться вновь.
Мендель не имел никаких сведений о местонахождении факторов в клетке, их химической природе, механизме влияния на признак и т. д. Однако менделевское учение о факторах как единицах наследственности легло в основу теории гена.
В самом конце XIX и начале XX века, независимо от работ Менделя, некоторыми исследователями-цитологами было высказано предположение о ядерной хромосомной локализации факторов наследственности. Это предположение основывалось главным образом на несомненной индивидуальности отдельных хромосом и большой точности их распределения при делении клетки.
В 1907 г. Иогансен ввел термин "ген", заменивший синоним "фактор". Дальнейшая конкретизация понятия "ген" тесно связана с выдающимися работами школы Моргана. Морган имел дело с чрезвычайно удобным объектом - плодовой мушкой Drosophila melanogaster, размножавшейся гораздо быстрее растительных объектов, использовавшихся в работах предшествовавшего периода. Кроме того, дрозофила имела лишь четыре пары хромосом, легко различавшихся по форме и величине.
Вначале Морган [1] изучал закономерности появления у потомства одной из мутаций, затрагивающей окраску глаз, т. е. наследственных изменений признака "белые глаза" вместо нормальных "красных глаз". Оказалось, что при скрещивании нормальных и мутировавших мух этот ген всегда проявлялся у потомков-самцов, но не у самок.
К тому времени уже было известно о существовании так называемых половых хромосом; в диплоидных клетках самок находятся две одинаковые хромосомы XX, у самцов - одна X-хромосома и одна Y-хромосома.
Было сделано предположение, что фактор окраски глаз у дрозофилы находится именно в Х-хромосомах. Тогда у самцов дрозофилы, имеющих лишь одну такую хромосому, гены, находящиеся в ней, будут свободно проявляться, не взаимодействуя со своими аллелями.
Открытие факторов, наследующихся сцепленно с полом, было первым доказательством хромосомной локализации генов.
В дальнейшем было показано, что в потомстве особей, различающихся по множеству признаков, эти признаки распределяются не беспорядочно, а группами. Между этими "группами сцепления" (как их стали называть) возможно свободное комбинирование. У дрозофилы были обнаружены четыре группы сцепления. Это соответствовало числу пар хромосом и свидетельствовало о том, что гены расположены во всех хромосомах, а не только в половых. Каждая группа сцепления была равнозначна одной хромосоме; собственно, гены потому и наследовались одной группой, что располагались на одной непрерывной материальной структуре.
Соответствие между числом групп сцепления и числом пар хромосом было найдено, кроме дрозофилы, и у других животных и растений.
На основании только что приведенных данных (и многих других, менее прямых доказательств), можно было заключить о хромосомной локализации генов; оставалось неизвестным, в каком порядке они располагаются в хромосомах. Этот вопрос был детально изучен в лаборатории Моргана; в основу легли следующие наблюдения.
Изучалось потомство, полученное от скрещивания родителей, различавшихся по признакам одной группы сцепления (например, черных мух с зачаточными крыльями и нормальных мух). У большей части потомства (83%) мутировавшие гены находились в одной группе сцепления, не комбинируясь с дикими. Однако в 8,5% случаев ген зачаточных крыльев был объединен в одной группе сцепления с геном серой окраски тела; ген черной окраски тела в 8,5% случаев также оказывался сцепленным с геном нормальных крыльев. Таким образом, наблюдалось перекомбинирование не только между группами сцепления, но и внутри этих групп.
Для объяснения полученных результатов было выдвинуто предположение о том, что обмен генами - лишь следствие обмена участками гомологичных хромосом, несущих эти гены (подобные процессы, напоминающие обмен хромосомного материала, уже наблюдались цитологами). Это явление получило название кроссинговера (перекреста).
Величина кроссинговера между любыми двумя генами одной группы сцепления была специфической для каждой пары. Очевидно, это отражало какое-то отношение между генами. Наиболее простым оказалось предположение, что это число отражает расстояние между генами.
В самом деле, если допустить, что кроссинговер происходит с приблизительно одинаковой частотой по всей длине хромосомы (так как определяется, в общем, случайными обстоятельствами), то чем дальше расположены гены, тем больше шансов, что они будут разделены кроссинговером; и наоборот, чем ближе гены, тем более вероятно, что кроссинговер между ними не произойдет.
Таким образом, открылась возможность построить план взаимного расположения в хромосоме известных генов (хромосомную карту) и вычислить приблизительное расстояние между ними (в процентах числа кроссинговерных потомков-рекомбинантов от общего числа скрещиваний). Кроме того, можно было нанести на такую карту каждый вновь выделенный ген, определив частоту его перекреста с уже известными генами.
Впрочем, уже сам Морган считал, что расстояния на картах в процентах кроссинговера не всегда могут совпадать с реальными расстояниями на хромосомах в линейных мерах длины. В 1922 г. он писал: "...Длина отрезка хромосомы, соответствующая единице расстояния (1%), может быть различной в разных районах хромосомы. Параллелью к картам может служить железнодорожное расписание поездов, в котором дано число минут между станциями. По такому расписанию можно точно судить о последовательности станций и лишь грубо - о фактическом количестве миль между ними" [2].
В 20-годах не обнаружили кроссинговер между аллельными генами. Поэтому аллельной парой стали считать два гена, расположенных на гомологичных хромосомах в строго идентичных участках (на схемах - друг против друга) и влияющих на развитие одного и того же признака.
Ген теперь представлялся как обособленный участок хромосомы, контролирующий один определенный признак, изменяющийся (мутирующий) как единое целое и неделимый при кроссинговере. Такое представление подчеркивало и преувеличивало дискретность гена. На хромосомных картах ген соответствовал геометрической точке, не имеющей измерений.
Взглядов на ген как на единицу функции, мутации и рекомбинации придерживались очень долго, хотя, как будет показано ниже, вскоре были получены факты, противоречащие этим представлениям.
Большое значение для исследований внутренней структуры гена имели работы, проделанные школой А. С. Серебровского [3]. В этих работах изучались мутации гена scute-achaete, приводящие к редукции щетинок на теле дрозофилы. Незадолго перед этим установили, что рентгеновы лучи обладают сильным мутагенным действием; благодаря этому стало возможным быстро получать большое количество самых разнообразных мутаций.
При исследовании нескольких мутаций гена scute-achaete, полученных таким путем, оказалось, что мутации, локализованные в одном и том же участке хромосомы, имеют не вполне одинаковое фенотипическое выражение (например, в одном случае сокращалось число щетинок на брюшке и на голове, в другом - лишь на брюшке, и т. д.). Это можно было принять за явление множественного аллеломорфизма; однако принципиально новой особенностью серии обнаруженных аллелей были необычные отношения между этими аллелями в гетерозиготе.
При скрещивании мутантов отношения доминантности-рецессивности проявлялись здесь не полностью; у потомства изменения были выражены лишь в тех участках тела, которые были изменены у обоих родителей (в приведенном выше примере - лишь на брюшке). Те участки, которые изменились лишь у одного из родителей, у потомства развивались нормально. Наследование происходило так, как если бы потомство было гомозиготно по признаку "щетинки на брюшке" и гетерозиготно по признаку "щетинки на голове". Однако речь шла об одном и том же гене, об одном и том же участке хромосомы; оставалось допустить, что этот ген состоит из участков со сходной функцией, каждый из которых контролирует развитие признака на определенной части тела дрозофилы и может самостоятельно мутировать. Явление получило название ступенчатого аллеломорфизма.
На основании этих данных А. С. Серебровским была создана так называемая центровая теория гена. Согласно этой теории весь ген (или базиген) может состоять из отдельных участков - центров, трансгенов, каждый из которых несет сходную функцию. Аллельные отношения внутри базигена между трансгенами такие же, как между отдельными функционально различными генами; мутация может нарушать деятельность одного из трансгенов, не затрагивая других.
Таким образом, эти работы поставили под сомнение два важных положения Моргана о природе гена: представление о гене как о единице, целиком изменяющейся при мутации, и представление о гене как о неделимой функциональной единице. Через несколько лет ревизии было подвергнуто и положение о гене как о единице кроссинговера. К этому привело изучение явлений псевдоаллелизма.
Псевдоаллелизм был вначале обнаружен у дрозофилы. При скрещивании мух с мутацией lozenge, локализованной в определенной области хромосомы и имеющей у всех мутантов одинаковое фенотипическое выражение (изменение строения глазных фасеток), среди очень большого числа потомков было получено, наряду с мутантными особями, некоторое количество дрозофил с диким генотипом [4]. Этот факт мог быть объяснен лишь тем, что мутационные изменения затронули два, хотя и расположенных рядом, но различных участка одного и того же гена; кроссинговер же прошел между ними, и в результате рекомбинации воссоздалась хромосома дикого типа. Таким образом, могли существовать мутации с одним фенотипическим проявлением, но разделимые кроссинговером (т. е. лежащие в различных, хотя и близко расположенных, точках гена). Поскольку считалось, что аллели занимают строго идентичные участки, мутанты с одним и тем же фенотипом, но рекомбинирующиеся при кроссинговере, стали называть псевдоаллельными.
Отношения в гетерозиготе между участками гена, расположенными на очень близких расстояниях, оказались непохожими на отношения между отдельными генами. До открытия явления псевдоаллелизма неизменно оказывалось, что гетерозигота, несущая в гомологичных хромосомах две пары аллельных генов (один из членов каждой пары был неизмененным, другой - мутировавшим), всегда обладает диким фенотипом. Это происходило и в том случае, когда неизмененные гены находились в одной гомологичной хромосоме, а их мутировавшие аллели - в другой (так называемое цис-положение), и тогда, когда аллельные пары располагались "крест-накрест", т. е. на каждой гомологичной хромосоме было по мутировавшему и неповрежденному гену - так называемое транс-положение (рис. 1). В транс-положении, следовательно, каждая хромосома имела по мутировавшему участку; однако в гетерозиготе неповрежденный участок гомологичной хромосомы "работал за двоих", и хромосомы функционально дополняли друг друга.
Рис. 1. Цис-транс-тест. Схематически изображены два гена, находящиеся в хромосоме I дрозофилы: ген lozenge (контролирующий развитие глаз) - слева, и ген miniature (контролирующий развитие крыльев) - справа. Расстояние между генами условное. На схемах 1 и 2 гетерозиготы, несущие мутации обоих этих генов, функционируют по дикому типу, независимо от того, находятся ли эти мутации в одной хромосоме (цис-положение, схема 1) или на разных (транс-положение, схема 2). На схемах 3 и 4 показаны две мутации (46 и 3 - порядковые номера мутаций) одного и того же гена lozenge. В данном случае, при локализации мутаций внутри одного гена, гетерозигота функционирует по дикому типу лишь тогда, когда мутации находятся в цис-положении (схема 3). В транс-положении (схема 4) она дает мутантный фенотип
Отношения взаимодополняемости, или комплементарности, между двумя парами генов наблюдались при любых расстояниях между этими парами, даже между соседними генами. Тем самым разделяемость кроссинговером и комплементарность для относительно крупных участков хромосом совпадали.
Казалось бы, что гетерозигота с двумя псевдоаллелями, находящимися в гомологичных хромосомах (т. е. в транс-положении), также должна обладать диким фенотипом, поскольку псевдоаллели разделимы кроссинговером. Однако фенотип такой гетерозиготы обычно был измененным. Следовательно, внутригенные отношения отличались от межгенных отсутствием комплементарности.
На основании этих закономерностей Льюис [51 предложил так называемый цис-транс-тест, позволивший решить, находятся ли два мутационных изменения в одном гене, точнее, в пределах одной функциональной единицы, или принадлежат разным генам. Если в гетерозиготе две мутации, находящиеся в цис- или транс-положении, допускают развитие дикого фенотипа, то эти мутации повреждают разные гены. Если же две мутации, находящиеся в цис-положении, допускают развитие дикого фенотипа, а в транс-положении приводят к развитию измененного фенотипа, то они занимают два участка одной функциональной единицы, хотя эти участки и могут быть разделимы кроссинговером (рис. 1).
Наиболее интересной особенностью, выявляющейся посредством цис-транс-теста, было своеобразное отношение между участками одной функциональной единицы. Льюис, а также К. Офферман [6] объясняли эти отношения следующим образом. Если предположить, что конечный продукт, вырабатываемый геном, возникает в результате ряда последовательных реакций, то для начала последующей реакции нужен продукт предыдущей. Такая цепь реакций происходит лишь на поверхности хромосомы: промежуточные продукты либо не могут диффундировать в цитоплазму, либо для реакции требуется непосредственный контакт реагентов на поверхности хромосомы. Поэтому для деятельности функциональной единицы нужна непрерывность соответствующего участка хромосомы, и в пределах функциональной единицы нет отношений комплементарности. Эти отношения возникают лишь между функциональными единицами, каждая из которых вырабатывает полноценный, поступающий в цитоплазму продукт.
Многолетние исследования структуры и функции гена, проведенные на высших организмах, дали к началу 50-х годов XX века результаты, которые можно резюмировать следующим образом:
Ген - это участок хромосомы, контролирующий развитие определенного признака. Ген обладает известной протяженностью и может быть поврежден в нескольких точках, что доказывается существованием мутаций, разделимых при кроссинговере. Ген комплексен, так как его отдельные участки могут несколько различаться по функции и в их совместной деятельности существует определенная субординация.
2. Некоторые особенности генетики микроорганизмов
Дальнейшему изучению тонкого строения генетического материала во многом содействовало введение нового объекта исследований - микроорганизмов. Своеобразная биология микроорганизмов и приемы работы с ними требуют некоторого пояснения.
Микроорганизмы стали применяться в качестве модели для генетических исследований с начала 40-х годов. До этого времени считалось, что по особенностям наследственного аппарата они сильно отличаются от высших организмов и закономерности генетики многоклеточных для них неприемлемы. Однако за последние 15-20 лет положение изменилось. Сперва было показано, что понятия генетики высших организмов применимы и к низшим; затем большинство исследований по биохимической генетике стали проводить лишь на грибах и бактериях; в настоящее время многие закономерности, установленные в опытах на микроорганизмах, ждут своего подтверждения и на многоклеточных.
Микроорганизмы, с которыми работали и работают генетики, очень разнообразны - иногда их сближают лишь микроскопические размеры и скорость размножения. К микроорганизмам обычно относятся и аспергиллы (многоклеточные организмы), дрожжи, различные бактерии кишечной группы, пневмококки, гемофильные бактерии, сенная палочка и, наконец, фаги преимущественно кишечной группы бактерий. Особняком стоят вирусы растений; наиболее часто как модель употребляется вирус табачной мозаики.
Работа с микроорганизмами имела ряд важных преимуществ. В большей части своего жизненного цикла микроорганизмы гаплоидны; гаплоидность при наличии и диплоидных форм давала дополнительные возможности изучения функционирования гена.
У микроорганизмов в гораздо большей степени, чем на прежних моделях, в понятие "признак" было вложено биохимическое содержание. Сначала на нейроспоре, а затем "на бактериях" удалось разработать способы получения и изучения биохимических мутаций. Было выделено множество мутантов, которые не росли без добавления в среду определенного вещества; при исследовании этих мутантов оказывалось, что у них нарушена та или иная ферментативная реакция. Обычно одной мутации какого-либо гена соответствовало выпадение функции одного определенного фермента; на основании этих данных Бидл сформулировал известный принцип - "один ген - один фермент". Этот принцип сохраняет свое значение и по настоящее время.
Микроорганизмы размножаются несравненно быстрее всех прочих "лабораторных животных" и дают огромное "количество поколений за короткие промежутки времени. Применяя селективную методику, из многих миллионов размножившихся особей можно было выделить несколько индивидуумов, обладающих свойствами, измененными в ожидаемом направлении. Поскольку разрешающая способность генетического анализа определяется числом произведенных скрещиваний, то даже для картирования хромосом (хорошо изученного на дрозофиле и других высших животных)*, микроорганизмы оказались очень полезным объектом. На них можно было легко изучить тесно соприкасающиеся генетические области, рекомбинации между которыми происходят настолько редко, что особи, несущие рекомбинированные участки хромосом, могут из-за своей малочисленности не встретиться в изучаемой популяции дрозофил.
* (Поскольку у микроорганизмов до сих пор не обнаружено морфологических образований, похожих на хромосомы многоклеточных, то правильнее было бы говорить о группах сцепления генов. Однако мы сочли возможным употребить этот термин из-за полной функциональной аналогии между группами сцепления у микроорганизмов и хромосомами.)
Получение гетерозиготы для проверки аллелизма и построения хромосомных карт достигается разными способами. Скрещиваются далеко не все микроорганизмы; из перечисленных выше истинный половой процесс наблюдается у нейроспоры, аспергиллов и дрожжей. Приходилось различными путями получать диплоидную клетку, в которой взаимодействовали аллельные гены, независимо от того, представлен ли второй партнер целым геном или только группой генов, среди которых есть и исследуемый (в последнем случае гетерозиготу иногда называют мерозиготой). Такое положение могло быть достигнуто разными путями. Вкратце остановимся на каждом из них, чтобы избежать пояснения в последующем тексте (см. также главу "Генетика бактерий").
Гетерокариоз. В этом случае в одной и той же клетке присутствуют два разных ядра, которые не сливаются, взаимодействуя лишь "на расстоянии" и конкурируя за управление тем или иным звеном в метаболизме клетки. Этот процесс обычно наблюдается у грибов. С помощью гетерокариоза могут быть проверены аллельные отношения между локусами [7].
Смешанная фаговая инфекция. Здесь взаимодействуют геномы фагов при смешанной инфекции бактериальной клетки. Взаимодействие может быть двух типов - "на расстоянии", как при гетерокариозе, и непосредственное с помощью кроссинговера, или по крайней мере с результатами, которые могут быть описаны в терминах кроссинговера. Роль гетерозиготы, доступной для наблюдения исследователя, выполняет клетка-хозяин - бактериальная клетка, лизис которой произойдет в зависимости от того, будут ли дополнять друг друга геномы проникших в клетку фагов-мутантов (каждый из которых по отдельности утратил лизирующую способность) [8]. О способах составления хромосомных карт фагов сказано ниже.
Завершенная трансдукция. При завершенной трансдукции партнерами являются целый геном одной бактерии и очень небольшой участок генома другой бактерии. Участок постороннего генома вносится в клетку фагом. Клетка проходит стадию мерозиготы, но не задерживается на ней, так как очень скоро происходит включение внесенного участка в хромосому бактерии-реципиента. О механизме включения можно лишь строить догадки; результаты включения могут быть описаны в терминах кроссинговера. При завершенной трансдукции можно построить карты взаимодействующих участков хромосом [9, 10].
Абортивная трансдукция. В случае абортивной трансдукции включения участка генома бактерии-донора в хромосому реципиента не происходит; этот участок, однако, присутствует на протяжении ряда поколений в бактериальной клетке, не удваиваясь при ее делении, но передаваясь одной из разделившихся клеток и взаимодействуя с соответствующим участком хромосомы реципиента по типу гетерокариоза. Кроссинговера здесь не происходит, но легко проверяются аллельные отношения [9, 10].
И завершенная, и абортивная трансдукции изучались преимущественно на таких бактериях, как салмонеллы и кишечная палочка.
Конъюгация. Это явление внешне напоминает половой процесс. Одна из бактериальных клеток слипается с другой; клеточные стенки в месте соприкосновения прорываются, и довольно значительный участок генома клетки-донора переходит в клетку-реципиент. Стадия мерозиготы после завершения конъюгации длится меньше, чем при абортивной трансдукции; через одно-два поколения происходит рекомбинация между внесенным генетическим материалом и хромосомой клетки-реципиента, и клетка вновь становится гаплоидной. Однако у некоторых штаммов этого не наблюдается и мерозигота существует много поколений [11].
Способность к переносу участка хромосомы связана с наличием в клетке-донора "полового фактора" - автономной частицы неизвестной природы, относимой к так называемым эписомам и по некоторым признакам напоминающей фага; это сближает конъюгацию с трансдукцией (см. главу "Генетика бактерий").
Конъюгация изучалась главным образом на бактериях кишечной группы; она также имеется и у некоторых других бактерий. С помощью конъюгации можно картировать относительно большие участки хрюмосом, а также проверять аллельные отношения.
Трансформация. При трансформации происходит, видимо, тот же процесс, что и при завершенной трансдукции; основная разница в том, что в данном случае участок генома (часть молекулы ДНК) донора поглощается клеткой реципиента без участия фага. Здесь также можно предположить очень кратковременное существование мерозиготы, а затем - включение внесенного участка генома в хромосому реципиента. Таким образом, в этом случае возможно построение карты очень небольшого участка хромосомы [12].
Трансформация применялась для исследования тонкого строения наследственных структур преимущественно у пневмококков и сенной палочки.
Таким образом, у микроорганизмов возможны (при изучении мерозигот и гетерокарионтов) как анализ аллельных отношений, так и построение хромосомных карт. Это и было использовано при изучении у данных объектов тонкой структуры гена.
Наибольшее влияние на современные представления о строении генетического материала оказали работы Бензера и других на бактериофагах [13-17]. Терминология, которая все чаще употребляется для обозначения субъединиц гена, была предложена именно в этих работах. Поэтому целесообразно рассматривать результаты, полученные на фагах, а затем сравнивать их с данными, известными из работ с другими микроорганизмами.
Следует коротко остановиться на объектах опытов Бензера и на некоторых особенностях этих опытов. У фагов кишечной палочки существует обширная группа мутантов r, образующих более крупные стерильные пятна на чашках с определенными штаммами бактерий, чем фаги дикого типа. Это связано с ускоренным лизисом клеток, откуда и происходит название мутантов r - rapid lysis). При росте на других бактериальных штаммах мутанты дают пятна той же величины, что и фаги дикого типа; на некоторых же штаммах эти мутанты вообще не могут расти.
Существует несколько групп мутантов r. Каждая из этих групп отличается от другой поведением при заражении какого-либо штамма кишечной палочки. Например, группа r II фага Т4 дает крупные пятна при заражении штамма В и вообще не дает пятен на штамме К; группа r III дает крупные пятна на штамме В, а также пятна нормальной величины - на штамме К. При картировании мутантов r обнаружилось, что таким различиям между группами этих мутантов соответствует их неодинаковое расположение на хромосоме фага.
Таким образом, мутации r - сборная группа сходных морфологических мутаций; биохимический механизм изменений фенотипа, наступающих при этом, пока что неизвестен.
В опытах Бензера исследовалось большое количество мутантов фага Т4 группы r II. Хромосомная область r II, в которой локализовались мутации этой группы, была приравнена к гену. В большинстве случаев у мутантов различного происхождения были повреждены неодинаковые участки этой области хромосомы; это доказывалось возможностью рекомбинации между такими мутантами. Рекомбинанты дикого типа возникали после одновременного заражения двумя мутантами бактерии В. Рекомбинанты можно было затем обнаружить, высевая размножившиеся фаги на штамм К (фаговые частицы дикого типа давали здесь пятна, в отличие от основной массы фагов-мутантов; поэтому даже очень редкие рекомбинации, порядка 10-6, удавалось легко выявить). На основании частоты появления рекомбинантов можно было (точно так же, как и у дрозофилы) определить взаимное расположение мутантов и относительное расстояние между ними, т. е. построить карту области r II (рис. 2). Картирование облегчалось тем, что среди точечных мутаций были и мутации, вызванные выпадением целых участков генетического материала - делеции. Такие мутации не давали рекомбинантов дикого типа при скрещивании с партнером, у которого мутация находилась в пределах, затронутых у первого фага делецией. Поэтому, подобрав мутанты с делециями, в сумме захватывающими весь ген r II, можно было сперва скрещивать с этими немногочисленными мутантами каждый новый мутант с неизвестной локализацией повреждения (а не подряд со всеми известными точечными мутантами). Затем, установив положение мутации в определенном участке гена r II, можно уточнить ее локализацию, производя скрещивание с мутантами, имеющими точечные мутации заведомо в данном участке. Считалось, что если между двумя точечными мутациями не происходит рекомбинации, то они занимают на хромосоме фагов идентичные участки.
Рис. 2. Карта расположения мутаций в участке r 164 области r II фага Т4. Участок r 164 - небольшая часть всей области r II; наверху указаны номера мутаций (например, r 385; r 131).