Глава V. Ген и признак (А. А. Нейфах)

1. Введение

Понятия "ген" и "признак" за свою столетнюю историю претерпели эволюцию, закономерную для всех научных понятий. Первым и важнейшим обобщением, которым мы целиком обязаны Грегору Менделю, было само введение этих понятий, их дифференциация, в результате которой признак и фактор, обеспечивающий его появление у потомства, - ген - стали рассматриваться, как нечто, существующее раздельно друг от друга. Дальнейшая эволюция генетики в значительной мере состояла и состоит в установлении материальной природы этих понятий и механизма их связи в наследственности и развитии.

Долгое время понятие "признак" не вызывало затруднений, и основная задача состояла в установлении природы гена. Локализация генов в хромосомах ядра и определение их дезоксирибонуклеиновой природы были основными этапами на пути решения этой задачи. Молекулярная структура хромосом и представление о границах гена и сейчас являются не вполне ясными. Более того, анализ тонкой структуры гена, произведенный в последние годы, привел к тому, что сам этот термин оказался недостаточным и в ряде случаев заменяется более частными понятиями - структурными: цистрон, мутон, рекон или функциональными: ген-регулятор, ген-оператор, структурный ген.

Сейчас, однако, очевидно, что и использование термина "признак" в том общем виде, как он раньше понимался, не является конструктивным и требует определенной конкретизации. Между геном и такими сложными наследуемыми "признаками", как, например, черты лица или интеллектуальная одаренность, стоит целая цепь признаков, занимающих, так сказать, более низкое иерархическое положение.

Эта цепь в самых общих чертах может рассматриваться в таком виде: ген → специфический белок → метаболизм веществ небелковой природы → клеточные органеллы и клетки → ткани → органы и, наконец, совокупность морфологической организации и функциональных свойств, составляющая весь организм с его особенностями строения и поведения.

Можно искусственно сузить и упростить проблему, если рассматривать в качестве признака только начальное звено - синтез специфических белков. У простейших организмов этого часто бывает достаточно. Но даже эту, наиболее успешно разрабатываемую сейчас область (ДНК → РНК → белок) еще нельзя считать исчерпанной. Дальнейший же путь генетической информации от белков к клеткам, органам и организму следует считать одной из самых трудных и важных проблем в современной биологии.

В данной главе мы только кратко коснемся той части проблемы, которая рассматривает генетический контроль белкового синтеза, поскольку она составляет основное содержание современной молекулярной биологии и будет полно представлена в других томах настоящего издания. Большое внимание мы сосредоточим на последующих этапах реализации генетической информации в развитии.

2. Внешние проявления связи признаков и генов

1) Неаллельные взаимодействия генов

Хорошо известно, что гены выявляются только при обнаружении мутантных аллелей. Этим объясняется тот факт, что даже у наиболее изученных объектов обнаружено не более одной десятой части всех генов и проявление каждого из них известно далеко не полностью. Поэтому в большинстве исследований каждый ген связывается с каким-либо одним признаком, и наоборот, для большинства наследуемых признаков известно по одному контролирующему их гену. Однако сейчас совершенно очевидно, что это может быть справедливо только для признаков, определяемых одним видом белка, таких, как ферментативная активность и антигенные свойства. В свое время это привело Бидла к концепции: "один ген - один энзим". Всякий более сложный признак, возникающий как следствие ряда последовательных биохимических реакций, определяется соответственно большим числом генов. В той степени, в какой химические реакции, протекающие в клетке и в организме, связаны друг с другом и взаимообусловлены, проявление одного гена зависит от проявления других.

В конечном итоге каждый сложный признак определяется значительным числом генов и по мере углубления исследований количество связей мёду признаком и различными генами все увеличивается. Отсюда справедливо и обратное положение: каждый ген в той или иной степени затрагивает не один, а большое число различных признаков (может быть, все признаки).

Приведем несколько классических примеров такого множественного, или плейотропного, действия генов на разные признаки и полимерного (полигенного) влияния нескольких генов на один признак.

При анализе наследственных уродств и леталей у мышей было установлено, что один и тот же ген вызывает целый ряд нарушений в строении различных органов и тканей. Все эти нарушения оказались связанными с угнетением процесса образования хряща из мезенхимных клеток [1]. Мутация - "конгенитальная гидроцефалия" - у 12-13-дневных зародышей выражается только в том, что в некоторых частях скелета синтез основного вещества вокруг хрящевых клеток замедляется. На более поздних стадиях это приводит к нарушениям в строении позвоночника, грудины, конечностей и черепа. Нарушения в развитии черепа, в свою очередь, ведут к уродству всех частей головы, и в частности к внутримозговым кровоизлияниям, следствием которых является смерть зародыша.

Другой вид хрящевых нарушений приводит к утолщению ребер, что ведет к целому ряду отклонений от нормы, которые проявляются не только в задержке развития. Наоборот, наблюдаемые при этом затруднения в дыхательных движениях грудной клетки (ригидность ребер) вызывают компенсаторное увеличение количества эритроцитов и гемоглобина в них, а также гипертрофию правого желудочка сердца [2, 3].

У сладкого горошка, который исследовал Мендель, желтый пигмент затрагивает не только сами горошины, но также и цветки, и черешки листьев [4]. Аналогичным образом один и тот же ген определяет пигментацию глаз, а также влияет на окраску покровов и некоторых внутренних органов дрозофилы. Во всех этих примерах одно первичное изменение (характер образования хряща, наличие пигмента) вторично сказывается на ряде органов и приводит к изменению нескольких признаков [5, 6].

Хорошим примером обратных отношений (зависимости одного признака от многих генов, т. е. полимерии) может служить окраска лепестков мака. Было установлено, что окраска каждого лепестка контролируется по меньшей мере десятью неаллельными генами [7]. Одни из них ответственны за синтез трех пигментов: цианидина, пеларгонидина и антоксантина. Другие определяют окраску пятна у основания лепестка. Третьи контролируют ацетилирование пигментов и понижение рН клеточного сока, четвертые ингибируют образование пигментов. Роль некоторых из этих десяти генов биохимически еще не установлена. Вагнер и Митчел на основании этих данных построили общую схему, в которой взаимодействие генов описано как конкуренция за общий субстрат [8]. Очевидно, однако, что при таком количестве компонентов системы может быть предложено несколько различных схем взаимодействия, которые позволят на основании данных о генотипе вывести фенотип, соответствующий экспериментальным результатам.

Подобные же отношения были описаны и для пигментации шерсти морских свинок и мышей. Окраска животных, если рассматривать ее как один признак, зависит и складывается из распределения волосков разного цвета по поверхности тела и окраски вдоль каждого волоска, степени окрашенности пигментных гранул, их размеров и, наконец, химических свойств самих пигментов. Все они контролируются различными генами, причем химический состав определяется рядом факторов, ответственных за последовательные ступени синтеза меланинов [9].

Рассматривая все эти примеры, легко убедиться, что понятия плейотропии и полимерии действия генов условны, поскольку условно само понятие "признак". Чем более сложное явление будет описано как один признак, тем большим количеством генов оно будет определяться, и наоборот, ген, ответственный за метаболическое звени, общее для многих процессов, естественно, будет контролировать многие сложные признаки. При переходе же к начальному звену - появлению специфических белков отношения между геном и признаком будут сводиться к "формуле Бидла: "один ген - один энзим" или Горовица: "один ген - одно действие".

Возникает вопрос: если отношения между генами так сложны и многообразны, то как объяснить успехи генетики начала этого века, когда без биохимического анализа, без индивидуализации белков и ферментов были установлены основные законы наследственности, описаны тысячи генов, составлены генетические карты хромосом у многих видов животных и растений? Дело в том, что, хотя в конечном итоге в реализации каждого признака участвуют многие гены, роль их далеко не одинакова к один или небольшое число хромосомных локусов связаны с тем или иным признаком более непосредственно. Это явление имеет определенную историческую предпосылку, и тенденция, ограничивающая плейотропию и полимерию, должна поддерживаться в эволюции.

Естественный отбор, как правило, связан не с элементарными биохимическими процессами, а с более сложными признаками, определяющими взаимоотношения организма со средой (только у микроорганизмов это практически одно и то же и выживаемость может определяться наличием одного ферментного белка). Если бы каждая мутация в разной степени затрагивала ряд признаков, то каждое полезное приспособление всегда сопровождалось бы появлением других бесполезных и даже вредных признаков. Эволюция при этом должна была сильно замедлиться, если не вовсе остановиться. С другой стороны, полимерия генетического действия способствует эволюции, так как изменение каждого признака возможно не одним, а несколькими путями и вероятность полезной мутации соответственно повышается. Увеличение полимерии при ограничении плейотропии должно приводить к увеличению общего числа генов, что и наблюдается в действительности. Взаимодействие генов, которое реально существует, отражает эти противоречивые тенденции и является эволюционно закрепленным оптимальным вариантом.

2) Аллельные взаимодействия генов

В этом разделе мы кратко рассмотрим явления, которые связаны с взаимоотношениями аллельных локусов в гомологичных хромосомах. Роль такого рода отношений в реализации фенотипа чрезвычайно велика, поскольку чистые гомозиготные линии в природе практически не встречаются и гетерозиготность по ряду признаков - нормальное явление. Два крайних примера этих отношений - полная доминантность и отсутствие доминантности - обычно иллюстрируются, с одной стороны, результатами опытов Менделя с горохом, в которых во втором поколении получают классическое расщепление 3:1, и, с другой-скрещиванием линий львиного зева, имеющих красные и белые цветки, дающие в первом поколении розовую окраску, а во втором - расщепление в отношении 1:2:1. Механизм данных отношений обычно описывается как отношения генов, образующих разное количество генопродуктов. Эти взгляды, по-видимому, будет трудно согласовать с современными представлениями молекулярной биологии. Мы вернемся к данному вопросу ниже, когда будем рассматривать первичное действие генов, а в этом разделе будем оперировать теми терминами, которые использовались в литературе до самого последнего времени.

Для некоторых признаков обнаружены серии аллелей одного гена, отличающихся количественно друг от друга. Для морфологических признаков это выражается в различной частоте появления той или иной особенности строения. Так, частота нормального жилкования крыла дрозофилы падает по мере того, как локус ci (cubitus interruptus - перерыв кубитальной жилки крыла) последовательно заменяется аллелями: +^ci, +², +³, ci^w [10]. Еще более отчетливо серия аллелей наблюдается при изучении количественных признаков, таких, например, как количество меланина в шерсти морских свинок [9]. Различные аллели гена С могут быть расположены в ряд, соответственно тому количеству меланина, которое определяется их присутствием в генотипе. Самое существенное состоит в том, что аллели в гомологичных хромосомах действуют независимо друг от друга. В этом можно убедиться, если, основываясь на предположении о такой независимости, подсчитать количество меланина, которое определяется каждым геном. Взяв особей, гомозиготных по той или иной мутации гена С, можно принять, что каждый из двух аллельных генов в диплоидном организме обеспечивает половину всего количества меланина. Тогда нетрудно теоретически подсчитать, сколько меланина должно содержаться в шерсти животных при всех возможных гетерозиготных комбинациях между разными мутантными аллелями гена С. Близкое совпадение теоретических величин с экспериментальными значениями показывает, что на самом деле каждый аллель действует независимо друг от друга.

Описаны, однако, опыты с, казалось бы, аллельными генами, которые трудно объяснить независимым проявлением действия аллельных генов в гомологичных хромосомах. Это хорошо иллюстрируется серией летальных генов Т у мышей (tailless - отсутствие хвоста) [11, 12]. В этой серии сейчас насчитывается более 12 аллельных генов: T, t⁰, t¹, t³, t⁴, t⁹, t¹² и др. В гетерозиготном состоянии доминантный ген T(T/+ дает жизнеспособное, но короткохвостое потомство. Остальные гены рецессивны и в комбинации с нормальным аллелем (t⁰/+, t¹/+, и т. д.) дают нормальное потомство, но в комбинации с Т (T/t⁰, T/t¹, T/t³ и т. д.) рождаются жизнеспособные мыши, полностью лишенные хвоста. В то же время в гомозиготном состоянии все они летальны, хотя гибель зародышей, несущих разные аллели, происходит в разные дни: Т/Т - на 11-й, t⁹/t⁹ - на 9-й, t⁴/t⁴ - на 8-й, t⁰/t⁰ - на 6-й, t¹/t¹ - на 5-й и, наконец, t¹²/t¹² - на 4-й день эмбрионального развития (к этой последней, самой интересной мутации, дающей наиболее раннюю гибель из всех известных, мы еще вернемся). Существенно, что хотя гомозиготные варианты летальны, их комбинация дает жизнеспособное потомство. Для объяснения этих фактов необходимо или отказаться от концепции независимого проявления действия аллелей, или предположить, что не все гены серии Т являются аллельными. В последние годы получены данные, подтверждающие это последнее предположение и показывающие, что серия Т состоит из небольших близко лежащих групп псевдоаллелей [5, 12, 13]. Таким образом, можно заключить, что аллельные гены в гомологичных хромосомах функционируют независимо друг от друга.

3) Влияние внешней среды

В этом разделе мы несколько искусственно выделим только те, внешние к функции генов влияния, источником которых является внешняя среда. О воздействиях внутренней среды клеток и организма мы уже говорили, когда речь шла о взаимодействии генов, и этот вопрос еще будет подробнее обсужден далее.

Реализация наследственных свойств организма не может осуществляться вне определенных условий среды. Однако при переходе от этого общего положения к конкретным примерам специфических влияний мы часто встречаемся с определенными трудностями, и количество таких примеров оказывается не очень велико. В процессе эволюции организмы приспособились к определенной внешней среде, которая стала непременным условием реализации генотипа в развитии. В то же время организмы приспособились и к естественным (случайным и закономерным) колебаниям этих условий, причем отбор шел на то, чтобы эти колебания возможно меньше затрагивали структуру и функцию развивающегося организма. Это достигается или путем создания определенных средств защиты (оболочки, запасы питательных веществ, забота о потомстве и т. д.), или с помощью процессов регуляции, позволяющих компенсировать все отклонения от нормы. Поэтому обычно только резкие, не встречающиеся в природе, физические или химические воздействия способны оказать заметный эффект на реализацию наследственности в развитии, т. е. на функцию генетического аппарата.

Температура

Среди факторов среды, которые оказывают заметный эффект на развитие, необходимо прежде всего остановиться на действии температуры. При этом следует отдельно рассматривать влияние колебаний температуры в пределах нормы, к которой приспособлен данный вид, и действие высоких сублетальных температур, вызывающих шоковый эффект и выступающих в качестве повреждающего физического фактора. Как и следовало ожидать, сублетальная температура оказывает повреждающий эффект на всех особей, независимо от их генотипа, в то время как температурные различия в пределах естественных колебаний не влияют на организмы с нормальным ("диким") генотипом, а сказываются в проявлении отдельных патологических мутаций. Обычно повышение температуры несколько усиливает повреждающий генетический эффект этих мутаций.

Для нейроспоры известно несколько мутантов, способных при температурах ниже 25-30° расти на среде, лишенной некоторых аминокислот (например, аргинина), витаминов (тиамина), нуклеотидов, но при повышении температуры до 30-40° утрачивается способность к синтезу этих метаболитов [14]. У нормального штамма кишечной палочки фермент, необходимый для синтеза пантотеновой кислоты из аланина и пантоата, достаточно термостабилен. Однако найден мутант, у которого этот энзим инактивируется уже при 25° [15]. Такая же высокая термочувствительность обнаружена у одного мутанта нейроспоры в отношении тирозиназы [16].

У гималайских кроликов меланин шерсти образуется при температуре не выше 25°, причем зависимость этого процесса от температуры неодинакова в разных частях тела. Поэтому кролики, развивавшиеся при 30°, совершенно белые, а при 25° - имеют черные уши, кончики носа и лап. При охлаждении кожи до еще более низких температур черную шерсть можно получить на любом участке тела [17]. Если продукты аллельных генов отличаются в отношении термостойкости, то изменение температуры может при некоторых условиях изменять степень доминантности генов. Классическим примером такой зависимости является мутация vestigial (vg), влияющая на размер и форму крыльев у дрозофилы. Площадь крыльев у гомозиготных мутантов vg^p/vg^p значительно больше, чем у vg/vg. При температуре 24° площадь крыльев у гетерозигот vg^p/vg (0,40 мм²) ближе к vg/vg (0,20 мм²), чем к vg^p/vg^p (1,20 мм²), но площадь крыльев у гетерозиготных мух vg^p/vg, развивающихся при температуре 30°, сильно возрастает (до 0,80 мм²), а у vg^p/vg^p несколько уменьшается (до 0,90 мм²) и в результате оказывается почти одинаковой. При той же температуре 30° площадь крыльев у vg/vg остается прежней - 0,20 мм². Таким образом, если при 24° ген vg доминировал над геном vg^p, то при 30° наблюдается обратное соотношение [18].

Уже упоминавшийся выше ген ci в гетерозиготном состоянии дает нарушение нормального жилкования крыльев дрозофилы при 14° гораздо чаще, чем при 26°. Наконец, ряд летальных мутаций совершенно не проявляется при низких температурах (ниже 16°), они полулегальны при 21° и ведут к гибели всех особей при 25° [19].

Высокие сублетальные температуры нарушают развитие личинок дрозофилы с нормальным генотипом. Получаемые при этом отклонения в развитии часто напоминают ту или иную мутацию; Гольдшмидт (1938), подробно исследовавший это явление, назвал их фенокопиями [20]. При действии сублетальных температур (35-37°) в течение 12-24 час. на разных стадиях развития личинок (от 4,5 до 7 суток) удается с высокой частотой получать внешнее подобие различных мутаций. Каждой из них соответствует определенный "критический период". Понятно, что потомству эти модификации развития не передаются. Гольдшмидт считает, что критические периоды, установленные для каждого типа фенокопий, совпадают с временем реализации соответствующего гена. Шоковая температура блокирует реакцию, контролируемую в нормальном "диком" генотипе геном, мутация которого приводит к тому же внешнему результату, что и фенокопия. Однако вряд ли можно думать, что этот метод прямо выявит время действия гена, так как сублетальная температура может влиять не на первичное действие гена, а на тот или иной этап осуществления его влияния.

Химические и другие внешние факторы

Аналогичные фенокопий удалось получить Рапопорту введением сублетальных доз цианидов, солей серебра и производных хинона [21, 22]. Маловероятно, что эти вещества оказывают прямое специфическое действие на функцию того или иного гена. Учитывая их общее действие на метаболизм, например, через подавление дыхания цианидами, можно представить, что одни процессы будут зависимы от уровня дыхания несколько больше, чем другие, и при сублетальной дозировке подавляются только они, в то время как все остальные требуют для своего угнетения несколько больших доз ингибитора. Подавление этих более чувствительных реакций и ведет к появлению фенокопий, похожих на мутации генов, контролирующих те же самые реакции.

Значительно более непосредственно и специфично роль тех или иных генов обнаруживается на микроорганизмах, у которых исследуются мутации, ответственные за их пищевые потребности. Так, мутация гена, контролирующего энзим, ответственный за синтез определенной аминокислоты, ведет себя как летальная, если этой аминокислоты в среде нет, и остается незамеченной, если аминокислота присутствует. У хлореллы отсутствие хлорофилла, обусловленное одной из мутаций, на обычной среде летально, так как фотосинтез, естественно, не происходит. Однако добавление глюкозы в среду обеспечивает рост и размножение этого беспигментного мутанта.

У травоядных животных имеются энзимы, разрушающие пигменты растений. В организме кроликов, гомозиготных по мутации гена, контролирующего синтез такого энзима, ксантофилл не способен разрушаться; он откладывается в их жире, который приобретает желтый цвет. Если не кормить этих кроликов зеленым кормом, то их жир будет обычного белого цвета.

В Новой Зеландии обнаружена рецессивная мутация овец, которая в гомозиготе выражается в том, что у ягнят, выпущенных на пастбища, развиваются экзема и воспаление кожи головы. Вследствие этого ягнята слепнут, не могут питаться и погибают от голода. Если же их воспитывать в защищенном от солнца помещении, они растут и развиваются нормально. Однако они могут без вреда находиться и на солнце, если их пища не содержит хлорофилла [23]. Оказалось, что у этих мутантов нарушена функция печени и они не способны экскретировать филлоэритрин - продукт распада хлорофилла. Это фотосенсибилизирующее вещество циркулирует у них в крови и под действием солнечного света вызывает воспалительную реакцию [24]. Летальность этого гена проявляется при наличии таких обычных для овец условий, как зеленый корм и солнечный свет. Выявление генетической роли внешних условий требует значительных усилий экспериментатора, тем более что исключить многие факторы среды оказывается практически невозможно.

В заключение можно привести еще один пример - наследственное заболевание человека - порфирию, когда в качестве модифицирующего фактора внешней среды выступают обычные снотворные. Эта мутация довольно часто встречается среди белого населения Южной Африки. Она обычно ведет к повышенному количеству порфиринов в крови и моче, что не угрожает жизни носителя этого гена пока он не принимает барбитуратов, которые являются для этих людей высокотоксичными [25].

Мы рассмотрели здесь только некоторые аспекты внешнего соответствия между геном и признаком. Такие важные вопросы, как, например, вопросы об эффекте положения или псевдоаллелизме, не могли быть здесь затронуты, хотя они, несомненно, заслуживают специального и подробного рассмотрения.

Первый этап развития генетики, естественно, должен был ограничиться двумя крайними пунктами процесса - геном и признаком, почти не касаясь механизма их действительной связи, которая реализуется в процессе развития. В данное время основные усилия исследователей проблемы "ген и признак" сосредоточены на этом механизме реализации.

3. Первичное действие генов

В настоящее время первичное действие генов связывается только с синтезом специфических белковых молекул и предполагается, что вся генетическая информация реализуется через белок. Это последнее утверждение встречает некоторые трудности. Однако предположение о прямой передаче информации с ДНК на небелковые молекулы пока совершенно гипотетично, в то время как зависимость ДНК → РНК → белок является строго доказанной, хотя не все детали этого процесса выяснены до конца. В первую очередь это относится к структуре ДНК в хромосомах и регуляции на них синтеза РНК.

1) ДНК - РНК

Макромолекулярная структура ДНК, предложенная Уотсоном и Криком, сейчас является общепринятой и широкоизвестной. Известен и состав других химических компонентов хромосом. Однако общая организация хромосом, их микроструктура, до сих пор остается совершенно неясной, и ни одна из предложенных моделей [26-28] не может быть окончательно принята. Основное и до сих пор неразрешенное противоречие состоит в том, что при всех оптических методах исследования хромосома представляется в виде пучка параллельно идущих нитей (хромонем), которые в конечном итоге составлены из двойных спиралей ДНК, соединенных с белком (или окруженных им?), в основном гистонового типа. В то же время генетические и радиогенетические исследования совершенно однозначно позволяют представить хромосому только как одну двойную спираль ДНК, вдоль которой последовательно располагаются гены. Но поскольку диаметр хромосомы в тысячи раз больше, чем ДНК, то ее нить должна быть многократно свернута (спирализована?) каким-то неизвестным образом. Задача осложняется еще и тем, что количество ДНК в клетке (по химическим определениям) по меньшей мере вдвое превосходит объем генетического материала, определяемого из количества и размеров генов. Проблема "негенетической ДНК" часто обходится в литературе, хотя совершенно очевидно, что без ее решения полное представление о механизме действия генов составить невозможно. "Негенетическую ДНК" можно обнаружить при сравнении эухроматических и гетерохроматических участков хромосом [29, 30]. Эти области несколько отличаются химически (в гетерохроматине, по-видимому, больше ДНК) и очень сильно - генетически. Почти все известные гены концентрируются в эухроматических районах и почти полностью отсутствуют в гетерохроматических. В последнее время гетерохроматину часто приписывается регуляторная роль и получены некоторые фактические данные в пользу этого предположения [31-33]. Однако в таком случае мутации или нехватки в гетерохроматиновых областях должны были бы вести к дезорганизации функций уже известных или еще неизвестных генов, т. е. выражаться фенотипически, чего, однако, не происходит [30].

Первым этапом реализации наследственности является синтез в ядре, на хромосомах, специфических молекул РНК, переносящих информацию от отдельных генов в цитоплазму. В настоящее время известны три типа РНК: 1) информационная, или мессенджер РНК (м-РНК), 2) рибосомная РНК (р-РНК) и 3) растворимая, или транспортная РНК (с-РНК, или т-РНК). Кроме того, может быть, к особому типу следует отнести РНК растительных вирусов как единственный тип РНК, способный к редупликации. Собственно генетическая информация от генов к признакам передается только через м-РНК, в то время как остальные типы РНК служат для осуществления этого процесса, хотя возможно, что и они несут некоторую генетическую информацию. Поэтому, рассматривая первичное действие генов, мы в основном будем говорить именно о м-РНК, хотя химически она изучена меньше других типов РНК.

Структурный механизм синтеза м-РНК изучен недостаточно. По-видимому, как и при дупликации, нити ДНК в месте синтеза отделяются друг от друга и создается гибридная молекула ДНК-РНК. Шпигельману удалось выделить комплексы ДНК-РНК из клеток высших организмов, используя тот факт, что при синтезе РНК эти молекулы отделяются от матрицы ДНК не сразу [34]. Такие гибридные молекулы могут быть получены in vitro при медленном охлаждении нагретого раствора ДНК и РНК [35, 36]. Гибриды возникают только в тех растворах, где вероятность встречи между комплементарными молекулами достаточно велика. Это наблюдается в опытах с фаговой ДНК и РНК из бактериальных клеток, зараженных тем же фагом. Количество генов в фаге относительно невелико и соответственно невелико число разновидностей РНК, образованных на этих матрицах. Встреча цистронов ДНК с комплементарными к ним молекулами РНК становится достаточно вероятной. У высших организмов количество генов в тысячи раз больше и из них в каждый момент функционирует лишь некоторая часть. При этом случайный контакт участков ДНК и РНК комплементарного строения оказывается статистически маловероятным и осуществляется только при особых условиях.

Синтез РНК на матрице ДНК был получен in vitro и состав вновь образованных молекул соответствовал нуклеотидному составу матрицы. Кроме матрицы, для синтеза РНК необходим субстрат синтеза - четыре рибонуклеозидтрифосфата (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ, где А - аденин, Г - гуанин, У - урацил и Ц - цитозин) и фермент РНК-полимераза. В процессе синтеза макроэргические фосфатные связи разрываются и их энергия используется на построение молекулы РНК -[37, 38].

В принципе процесс комплементарного синтеза РНК на матрице ДНК не должен был бы отличаться от дупликации самой ДНК. Действительно, между этими процессами имеется определенное сходство. В обоих случаях субстратом служат трифосфатные производные нуклеозидов, а матрицей - молекула ДНК, в которой разделена двойная нить и вновь образующаяся молекула подстраивается к одной из нитей. Отличия в дупликации ДНК и синтезе РНК состоят не только в том, что ДНК строится из дезокоириболуклеозидтрифосфатов, а РНК из рибонуклеозидтрифоофатов, но и в том, что тиминовое основание ДНК заменено в РНК урацилом. Принципиальное отличие заключается еще и в том, что ДНК дуплицируется целиком во всей хромосоме [28] (хотя и не одномоментно), а РНК синтезируется лишь у отдельных локусов хромосомы, причем в каждый момент в клетке функционирует лишь небольшая часть всех локусов.

Механизм избирательной активности отдельных генов пока еще известен очень мало; сейчас можно говорить только о двух факторах, непосредственно подавляющих (репрессирующих) первичную функцию генов. Генетический механизм репрессии был открыт Жакобом и Моно у бактерий и состоит в том, что функция одних генов непосредственно контролируется другими [39, 40]. По этой хорошо обоснованной для бактерий схеме, предполагается, что геном-регулятором выделяется вещество-репрессор, по-видимому рибонуклеиновой природы, которое действует на ген-оператор, обычно расположенный в непосредственном контакте с самим объектом регуляции - структурным геном. Как мы увидим ниже, эта схема, созданная для индуцированного синтеза ферментов, не является общей и для высших организмов должна быть более или менее модифицирована. Вторым фактором, репрессирующим функцию генов, является связь ДНК с белками гистоновой природы. Специфическая локализация гистонов в хромосомах и тесная химическая связь с ДНК позволяют предполагать их участие в регуляции первичной генетической функции. В последние годы были получены экспериментальные подтверждения этой концепции. Было показано, что добавление гистонов блокирует синтез РНК и белка в ядрах тимуса [41]. Наоборот, частичное освобождение ДНК от гистонов путем их мягкого переваривания трипсином вызывало усиление синтеза РНК. При этом состав вновь синтезированной избыточной РНК отличался по нуклеотидному составу от РНК, которая обычно синтезируется в ядрах тимуса. Авторы предполагают, что неспецифическое удаление гистонов привело к активации таких локусов ДНК, которые обычно являются зарепрессированными.

По-видимому, два указанных способа блокирования генетической функции ДНК не исключают друг друга, а являются выражением одного механизма. Некоторые авторы предполагают, что механизм действия гена-оператора состоит в синтезе гистонов, которые закрывают соответствующий участок ДНК. Представления эти остаются крайне гипотетичными.

Переносчики генетической информации - молекулы м-РНК - имеют молекулярный вес порядка 5⋅10⁵ и константу седиментации с пиком около 14S. Данные величины являются средней величиной с довольно широким размахом вариаций от молекулярного веса, равного 1⋅10⁵ до 2⋅10⁶ [42]. Этот широкий диапазон вариабильности вполне понятен, так как он соответствует вариации размеров белковых молекул, которые предопределяет м-РНК. Количество м-РНК в клетке не превышает 1-2% от всей РНК. Химическое ее выделение представляет значительные трудности, но в последнее время наметилось несколько методов, основанных на способности ее связываться с ДНК.

Особые трудности до сих пор составляет выявление м-РНК в цитоплазме высших организмов [43]. В ядрах эта фракция РНК относительно легко может быть обнаружена в опытах с мечеными предшественниками, когда нуклеиновые кислоты разделяют на фракции по адсорбции на колонке или по константе седиментации. Однако значительная часть меченых соединений распадается, не покидая ядра, и в цитоплазме только немногим исследователям удалось найти некоторое количество м-РНК, связанное с рибосомами [44]. Таким образом, такое важное звено переноса генетической информации, как ее выход из ядра в цитоплазму, до сих пор является малоизученным разделом проблемы [45].

2) РНК-белок

Первый шаг переноса информации - с ДНК на РНК - теоретически не является сложным, поскольку перекодирование состоит только в том, что тимин замещается урацилом, а рибоза - дезоксирибозой. Настоящее и значительно более сложное перекодирование происходит на следующем этапе переноса информации от РНК к последовательности аминокислот в полипептидной цепочке [46]. И если первый этап требует лишь субстратов синтеза РНК и одного фермента, то на следующем этапе участвует множество высоко- и низкомолекулярных компонентов. В чисто информационном плане для нас существенна лишь проблема кода, согласно которому в м-РНК кодируется аминокислотная последовательность. Однако и механизм реализации этого кода, как сейчас установлено, также представляет собой важную информационную проблему. В последние три - пять лет в обеих этих направлениях, которые до сих пор находятся в центре внимания биохимиков, были достигнуты значительные успехи.

После работ Крика [47, 48] стало очевидно, что каждая аминокислота кодируется тремя соседними нуклеотидами, причем код является неперекрывающимся, т. е. каждой аминокислоте в полипептидной цепи соответствует отдельная тройка нуклеотидов. После ряда малоуспешных попыток подойти к проблеме кода косвенными путями, Ниренбергом был предложен прямой метод анализа, основанный на синтезе полипептидной цепочки in vitro на матрице синтетической РНК с известным соотношением случайно расположенных нуклеотидов. Совместными усилиями различных лабораторий в короткое время были получены значительные результаты [49, 50]. К настоящему времени из 64 возможных последовательностей трех нуклеотидов для 60 предложено кодовое значение. При этом выяснилось, что код является вырожденным, т. е. одна аминокислота может быть закодирована несколькими различными тройками нуклеотидов. Существует много оснований для предположения, что код является универсальным у всех живых организмов, но прямых экспериментальных данных пока недостаточно, чтобы считать это доказанным.

Серьезное подтверждение достоверности найденного кода было получено при анализе мутаций, для которых точно известно, какие изменения при этом претерпевают белковые молекулы. Оказалось, что в ряде случаев мутационная замена одной аминокислоты на другую сопровождается заменой в нуклеотидном триплете только одного нуклеотида из трех. Так, для вируса табачной мозаики известен последовательный ряд мутаций, где в одном и том же участке молекулы белка треонин заменяется на серии, серии на фенилаланин, фенилаланин на тирозин. Согласно триплетному коду, это соответствует замене: ЦУА → ЦУУ → УУУ → УАУ, т. е. каждая мутация является результатом изменения только одного нуклеотида [51]. Аналогичным образом для гемоглобина известны мутанты, в которых глютаминовая кислота заменена валином, глютамином или лизином. Это соответствует замене триплета АУГ на УУГ, АГГ или АУА (опять в каждом случае заменяется только один нуклеотид триплета) [52].

Большие успехи были достигнуты также и в изучении механизма перекодирования, т. е. синтеза полипептидной цепи соответственно матрице РНК. Строение аминокислот и нуклеотидных триплетов не является комплементарным, как у двух цепочек ДНК или даже ДНК и РНК, и прямое перекодирование оказывается невозможным. Крик в 1958 г. выдвинул идею "адапторов" - молекул-дешифраторов как бы с двумя поверхностями: одной, имеющей сродство к определенной аминокислоте, а другой - к соответствующему триплету в полинуклеотидной цепи РНК [53].

Таким образом, должно существовать еще два кода: от аминокислот к адаптору и от адаптора к м-РНК. В результате работ Хогленда и ряда других авторов этото механизм стал во многом понятен [см. 45]. Адаптером являются молекулы растворимой относительно низкомолекулярной РНК (с-РНК). Первый этап синтеза белка - активация аминокислот АТФ и присоединение активированной аминокислоты к соответствующей молекуле с-РНК. Этот процесс катализируется специфическими ферментами - аминоацил-РНК-синтетазами. Каждый фермент специфичен для одной аминокислоты, т. е. видов аминоацил-РНК-синтетаз имеется не меньше, чем видов аминокислот. Молекулы с-РНК также специфичны; сейчас еще не выделены специфические с-РНК для всех аминокислот, но для некоторых это уже сделано. Молекулы с-РНК сходны между собой в отношении молекулярного веса (25000) и строения концевых групп фГф - РНК - фЦфЦфА. Однако последовательность нуклеотидов, идущих после аденозин-цитозинового окончания, у разных типов с-РНК различна: этим достигается их специфичность. Специфичность с-РНК выше, чем это необходимо для присоединения данной аминокислоты, т. е. один вид аминокислоты может присоединяться к с-РНК двух-трех типов. Иными словами, код аминокислота - с-РНК тоже оказывается вырожденным, и типов с-РНК больше, чем типов аминокислот.

Специфичность присоединения аминокислоты к определенным типам с-РНК определяется не комплементарностью их строения (концевая группа, к которой присоединяется аминокислота, у всех с-РНК одинакова), а действием специфического фермента.

Таким образом, между геном (ДНК) и продуктом его активности имеются по меньшей мере четыре этапа кодирования: между триплетом ДНК и триплетом РНК, между аминокислотой и ферментом (аминоацил-РНК-синтетаза), между ферментом и молекулой с-РНК и, наконец, между аминоацил-РНК-комплексом и триплетом m-PHK.

Молекулы с-РНК могут участвовать в переносе аминокислот неоднократно, но синтез их происходит довольно интенсивно. Показано, что синтез с-РНК, как и всей РНК, осуществляется на ДНК и также блокируется ингибиторами синтеза ДНК → РНК [54].

Третьим видом РНК является рибосомная РНК. На рибосомах происходит встреча м-РНК с с-РНК и собственно синтез белка. Рибосомы образованы из двух рибонуклеопротеидных компонентов с константами седиментации - 30S и 50S. Механизм действия рибосом остается совершенно неясным. Предполагается, что молекула м-РНК, которая лишь немного меньше рибосом (85- 305), располагается между обеими неравными частями рибосомы. У бактерий с индуцированным синтезом ферментов одна молекула м-РНК принимает участие только в синтезе немногих молекул белка, разрушается и ей на смену приходит другая молекула м-РНК. У высших животных это определенно не так. На различных объектах показано существование долгоживущей м-РНК, длительное время функционирующей без участия ядер. Синтез гемоглобина в безъядерных ретикулоцитах, синтез белка в ранних зародышах, лишенных ядер, синтез белка в клетках, обработанных актиномицином, - все это показывает, что в клетках высших организмов м-РНК может быть длительное время связанной с рибосомами и участвовать в синтезе не одной белковой молекулы. Однако время жизни м-РНК все же ограничено - в одних случаях быстрее, в других медленнее, но интенсивность белкового синтеза в безъядерных клетках или в клетках с заблокированной ДНК постепенно уменьшается и, наконец, совсем прекращается [55].

Важным вопросом, который долгое время стоял на повестке дня, был вопрос о специфичности рибосом, или, в более общей форме, - о роли рибосомы в определении белковой структуры. Целый ряд опытов, таких, как синтез in vitro при комбинации рибосом и м-РНК различного происхождения (млекопитающие, бактерии, вирусы), показал, что специфичность белка целиком определяется м-РНК независимо от происхождения рибосом. Единственным доводом против этих экспериментов является тот факт, что во всех этих опытах активно себя ведет только некоторая часть рибосом, часто не более 10%. Это может быть вызвано тем, что остальные рибосомы уже были связаны с м-РНК во время их выделения и что различные рибосомы связаны с разными типами м-РНК и таким образом могут определять если не специфичность, то хотя бы интенсивность белкового синтеза.

В клетке рибосомы часто образуют комплексы из нескольких (5-10) рибосом - полисомы [48], соединенные одной молекулой м-РНК. Есть предположение о том, что различные компоненты полисом участвуют в синтезе разных частей белковой молекулы (участков полипептидной цепи или разных цепочек) или функционально дифференцированы иным образом. Возможно, также, что полисомы как-то участвуют в создании третичной структуры белковой молекулы. До тех пор пока структурный механизм синтеза белка на рибосомах не станет ясным, все эти вопросы не будут окончательно решены.

3) Конформация белков

Нуклеотидная последовательность в ДНК однозначно определяет только последовательность аминокислот - первичную структуру белка. Однако строение и свойства белковой молекулы не могут быть описаны только первичной структурой. Полипептидная цепочка обычно закручена вокруг ее длинной оси (α-спираль), образуя вторичную структуру молекулы. Кроме того, полипептидная спираль складывается определенным образом в третичную структуру. Наконец, многие сложные белковые молекулы составляются из нескольких полипептидных цепей, что может быть названо четвертичной структурой белка. Все эти структуры (конформация молекулы) определяют функциональные свойства белка; следовательно, их наследственная обусловленность является существенным звеном проблемы "ген и признак".

Вторичная структура полипептидной цепи, по-видимому, однозначно определяется аминокислотной последовательностью, так как является функцией стехиометрических отношений между соседними аминокислотами [56]. Третичная конфигурация также зависит от аминокислотной последовательности, но определяется ею не однозначно. Это лучше всего иллюстрируется сравнением нативного и денатурированного белков, имеющих одинаковую первичную структуру, но совершенно разные конфигурации и, как следствие этого, разные функциональные свойства. Третичная структура существует за счет наличия водородных и S-S-связей между частями молекулы. При нарушении этих связей (повышение температуры, денатурирующие вещества) упорядоченная конфигурация молекулы нарушается и, как правило, восстановиться уже не может. Это определенно показывает, что создание третичной структуры требует определенной информации, сверх той, которая содержится в аминокислотной последовательности. Никаких данных об источнике-этой информации пока нет. Очень вероятно, что особого источника такой информации, специфичного для каждого вида белка, и не существует, а те конкретные условия, которые создаются на любой рибосоме, определяют одну третичную конфигурацию-из возможных при данной аминокислотной последовательности, контролируемой м-РНК. Можно также предположить, что существует несколько типов рибосом, каждый из которых несет ответственность за определенный тип конфигураций третичной структуры. Но в таком случае должен существовать механизм, обеспечивающий соединение определенной группы м-РНК только с одним типом рибосом. Наконец, как крайний вариант можно было бы предположить, что последовательность аминокислот и третичная структура белка кодируются независимо и м-РНК несет оба вида информации. Для этих гипотез никаких фактических данных пока нет и неизвестно ни одной мутации, которая изменяла бы свойства белка, не затрагивая его аминокислотной последовательности. Наоборот, в ряде случаев, изменения в одной аминокислоте приводили к нарушениям именно третичной структуры. Примером такого рода мутаций является серповидноклеточная анемия [52], которая вызывается заменой аденина на тимин в одном участке ДНК. Это приводит к тому, что при образовании м-РНК вместо триплета УАГ в данном участке молекулы возникает триплет УУГ; при синтезе гемоглобина это выражается в замене глютаминовой кислоты на валин. Такая замена не влияет на способность гемоглобина связывать кислород, но приводит к тому, что в восстановленном состоянии (в венозной крови) конфигурация молекул изменяется так, что нарушается форма эритроцитов (становится серповидной), это часто приводит к их разрушению. Отсюда следует анемия и далее целый комплекс нарушений сердечно-сосудистой и других систем. Этот пример является одним из немногих, когда весь путь от гена до признака прослежен с максимально возможной детальностью. Для проблемы генетического контроля над конформацией белков важен тот факт, что одним из звеньев этого пути было нарушение третичной структуры белка, вызванное изменением аминокислотной последовательности.

Проблема четвертичной структуры является еще более сложной, поскольку разные полипептидные цепи, входящие в одну молекулу, имеют различное генетическое происхождение. Четвертичная структура обнаружена у таких жизненно важных белков, как инсулин, гемоглобин, лактико- и малико-дегидрогеназа и др. Строения разных полипептидных цепей, входящих в одну молекулу, часто мало отличаются друг от друга, что явно указывает на их общее эволюционное происхождение. Так, например, молекула гемоглобина состоит в норме из двух α- и двух β-цепей [52]. Они приблизительно равного размера: 141 аминокислотный остаток в α-цепи и 146 - в β-цепи. В 61 звене аминокислоты обеих цепей совпадают, а, кроме того, аминокислоты, не совпадающие в гомологичных участках, в большом проценте случаев определяются триплетами, отличающимися на один нуклеотид, т. е. эти отличия могут быть результатом одной мутации.

У зародышей млекопитающих известен гемоглобин - F, у которого вместо β-цепей располагаются γ-цепи. γ-Цепь как и β-цепь, содержит 146 аминокислотных остатков, причем в 104 звеньях эти остатки в обоих полипептидах общие. Все три типа цепей определяются тремя близко расположенными генами: α, β и γ. Ген α функционирует в течение почти всей жизни организма, начиная с появления собственного кроветворения. Ген γ функционирует только в эмбриональной жизни, а ген β - во взрослой жизни организма. Смена их функций происходит постепенно, начиная с конца седьмого месяца эмбрионального развития и завершаясь в норме к пятому-шестому месяцу после рождения ребенка. При некоторых наследственных заболеваниях, связанных с мутацией гена β, синтез этих полипептидов подавляется и тогда компенсаторно усиливается синтез γ-цепи. Это выражается в большем или меньшем количестве эмбрионального гемоглобина у взрослого человека.

Для решения проблемы о четвертичной структуре белков необходимо выяснить, как встречаются и как специфически соединяются друг с другом полипептидные цепи, составляющие одну молекулу. Данные о первом этапе этого процесса были получены при исследовании недавно возникшей проблемы изозимов [57].

Некоторые ферменты, в частности лактикодегидрогеназу и маликодегидрогеназу, даже выделенные в чистом виде, удается при электрофорезе на крахмальной колонке разделить на фракции, обладающие сходной ферментативной активностью, но различающиеся по некоторым физико-химическим свойствам и оптимуму действия. Этих фракций обнаружено пять, но в разных органах и на разных стадиях развития относительная доля каждой фракции оказывается различной. Было установлено, что молекулы этих ферментов состоят из четырех полипептидов двух типов: А и В, которые генетически контролируются двумя различными локусами. Молекула фермента может быть представлена следующими комбинациями из двух типов полипептидов по четыре в молекуле: АААА, АААВ, ААВВ, АВВВ и ВВВВ. В зависимости от активности локусов, определяющих структуру обоих полипептидов, образуется различное количество А и В-компонентов и пропорционально этим количествам образуется различное соотношение пяти возможных комбинаций, составляющих молекулу. Эти данные позволяют сделать чрезвычайно важное утверждение: соединение полипептидов в одну молекулу подчиняется простым статистическим закономерностям, т. е. происходит случайно. Это, в свою очередь, указывает на то, что каждый полипептид образуется независимо друг от друга, а их соединение происходит уже после их синтеза и вне места синтеза. Нельзя, однако, исключить и возможности независимого образования молекул м-РНК, соответствующих одной и другой цепи, которые затем прикрепляются к соседним рибосомам и синтез всех компонентов будущей молекулы происходит в ограниченном пространстве. Такое предположение кажется, однако, маловероятным, поскольку оно опять требует специфического сродства молекул м-РНК к определенным рибосомам (недостатки этой гипотезы уже обсуждались).

Полипептиды А и В в случае рассматриваемых ферментов, так же как полипептидные цепочки 0 и Y ДЛЯ гемоглобина, очевидно, очень похожи друг на друга, поскольку они могут заменять друг друга, почти не влияя на функциональные свойства молекулы. Это же определяет свободную замену А и В друг другом при образовании сложной четырехкомпонентной молекулы. При большем различии полипептидов, как в случае α- и β-цепей, такой свободы уже не существует и молекула гемоглобина всегда содержит два полипептида а и два других - β или γ. Эти данные интересны для понимания второго этапа образования четвертичной структуры - механизма соединения уже встретившихся полипептидов в одну молекулу. Здесь также возможны две крайние точки зрения: полная зависимость этого процесса от структуры самих полипептидов (в конечном счете от аминокислотной последовательности) и полная зависимость от внешнего источника информации (специальной матрицы и т. д.). В настоящее время первое представление имеет большее число сторонников, чем второе. Соединение глобиновых молекул с гемом, их связь друг с другом, по-видимому, являются единственно возможными видами связей и не требуют специальных матриц или иных механизмов, определяющих данное, а не иное соединение.

Подводя итог всему этому разделу, мы должны заключить, что, хотя структура белковой молекулы (включая все ее виды, кроме первичной) играет исключительно важную роль в осуществлении функции белков, проблема ее возникновения в значительной степени сводится к созданию первичной структуры, т. е. специфической последовательности аминокислот. По мере накопления новых фактов у нас остается все меньше оснований считать, что существуют специальные приспособления для создания вторичной, третичной или четвертичной структуры. И если конфигурация белка и не однозначно вытекает из первичной структуры полипептидной цепи, то в конкретных специфических условиях, в которых происходит белковый синтез в клетке, создается только одна из возможных конфигураций белка, способная выполнять физиологическую роль, для которой она была создана в эволюции.

4) Регуляция белкового синтеза

Сейчас, когда качественно намечены основные этапы реализации наследственной информации в клетке, решение проблемы регуляции белкового синтеза надо рассматривать как одну из первоочередных общебиологических задач. Несмотря на ряд успехов в этой области, проблема еще далека от разрешения и на сегодняшний день нам не известны, по-видимому, основные механизмы этого процесса. Наибольшие результаты в последние годы были достигнуты на микроорганизмах, где индуцированный синтез ферментов оказался самым доступным объектом для исследования механизма регуляции. В литературе [58] изложение проблемы регуляции синтеза белка обычно сводится к теории индуцированного синтеза Жакоба и Моно. Однако мы еще не имеем данных, чтобы решить, в какой степени это свойство микроорганизмов отражает общие механизмы регуляции генетических функций, а в какой - специфические особенности этой группы организмов.

У бактерий синтез некоторых метаболически важных ферментов происходит только в том случае, если в среде присутствует субстрат их действия. Примитивные представления о том, что стимулом к увеличению энзиматической активности является сам процесс взаимодействия фермента и субстрата, были оставлены после того, как были найдены аналоги субстратов, индуцирующие синтез фермента, но неспособные вступать с ним во взаимодействие, и аналоги, наоборот, способные вступать в реакцию, катализируемую ферментом, но не индуцирующие его синтез. Классическим примером такого рода отношений может служить образование у кишечной палочки фермента, гидролизирующего лактозу, - β-галактозидазы. Его синтез может быть индуцирован не только самой лактозой, но и ее отдаленными аналогами - изопропилтиогалактозидом или метилтиогалактозидом, неспособными расщепляться этим ферментом. Зато другой аналог - фенилгалактозид хорошо гидролизуется галактозидазой, но не индуцирует ее синтеза. Очевидно, что индукция синтеза фермента и его функция - совершенно различные процессы, которые оказались в эволюции связанными друг с другом в результате приспособления к появлению и исчезновению из среды определенного вещества - лактозы. Биохимический и генетический анализ процесса индукции, подробно разбираемый во многих руководствах [58] и обзорах [40], привел к открытию трех типов генетических единиц, о которых уже говорилось выше: структурного гена, гена-регулятора и гена-оператора. Информация о самом ферменте содержится только в структурном цистроне, который у Е. coli расположен рядом с другими цистронами, обеспечивающими усвоение лактозы. В частности, они определяют синтез пермеазы, ответственной за проникновение лактозы в клетку. Эта группа цистронов образует "оперон", который включается и выключается одновременно, благодаря действию гена-оператора, обычно расположенного в том же локусе. Механизм действия гена-оператора неизвестен, но предполагается, что он связан с гистонами. Включение гена-оператора осуществляется посредством гена-регулятора, располагающегося в другом участке хромосомы. Продукт деятельности гена-регулятора специфически блокирует ген-оператор и весь связанный с ним оперон. Лактоза специфически связывается с продуктом гена-регулятора - веществом-репрессором и тем самым дерепрессирует ген-оператор и включает процесс образования м-РНК, обеспечивающей синтез β-галактозидазы и пермеазы. После смены среды или усвоения всей лактозы репрессор перестает связываться и функция оперона снова выключается.

Эта схема, несмотря на ее сложность, была чрезвычайно хорошо обоснована авторами и уже в течение нескольких лет не встречает серьезных возражений. Недавно показано, например, что индукция синтеза галактозидазы приводит к увеличению количества м-РНК, избирательно комплементарной к гену lac [59]. Однако попытки использовать схему по отношению к высшим организмам показали, что целый ряд ее обоснований, справедливых для бактерий, не подтверждается на многоклеточных организмах.

Прежде всего это касается самого факта индукции. Индуцированный синтез ферментов у млекопитающих, был обнаружен лишь в единичных случаях, хотя и предпринимались многочисленные попытки его обнаружения. Так, в ответ на введение триптофана в печени крыс возрастает активность триптофан-оксидазы. Еще несколько примеров было найдено на куриных эмбрионах [60]. Многообещающе прозвучало сообщение об индуцированном синтезе ряда ферментов в изолированных клетках зародышей амфибий [61], однако эти результаты не удалось (Подтвердить [62]. Следует отметить, что и у бактерий синтез далеко не всех ферментов является индуцированным и что у определенных штаммов Е. coli даже галактозидаза синтезируется вне связи с субстратом, т. е. является конститутивным ферментом.

Второй важной особенностью бактерий является нестабильность их м-РНК, которая участвует, как правило, в синтезе только одной белковой молекулы. Эта особенность требует постоянной активной генетической функции для обеспечения белкового синтеза, но, с другой стороны, дает возможность быстро реагировать на изменения в среде изменениями набора синтезируемых ферментов.

У высших организмов значительная часть м-РНК является относительно долгоживущей и продолжительность ее функционирования сильно различается как между тканями, так и в пределах одной клетки. Это иллюстрируется опытами Дэвидсона, Олфри и Мирского [55]. Добавление актиномицина. D к культуре тканей сразу блокирует синтез РНК, но не ведет к прекращению белкового синтеза. В то же время интенсивность синтеза многих белков начинает уменьшаться сразу после блокирования синтеза РНК, что указывает на непосредственный постоянный генетический контроль над синтезом этих белков: чем скорее падает скорость синтеза, тем короче продолжительность жизни молекул м-РНК. Этот процесс, однако, продолжается много часов, в то время как добавление пуромицина, непосредственно действующего на функцию рибосом, блокирует синтез белка немедленно. Синтез полисахаридов также начинает уменьшаться после действия актиномицина, но и после добавления пуромицина он прекращается не сразу, так как является функцией не собственно белкового синтеза, а концентрации соответствующих ферментов. Однако для синтеза белков в митохондриях получены совсем другие результаты. Добавление актиномицина практически не сказывается на активности сукцинодегидрогеназы в течение суток.

Таким образом, степень зависимости белкового синтеза оказалась различной для разных белков клетки. В этой работе, правда, не учитывалась продолжительность жизни самих белков; возможно, что белки митохондрий вообще обмениваются медленнее, чем белки гиалоплазмы.

Зависимость синтеза различных белков от ядер в эмбриональном развитии была показана в нашей работе на зародышах рыб. Функция ядер выключалась действием высоких доз радиации на мужские и женские половые клетки перед оплодотворением. После искусственного оплодотворения облученных и необлученных яиц облученными и необлученными спермиями получались четыре варианта зародышей: нормальные диплоиды, гаплоиды с облученной цитоплазмой (облучение яйца), гаплоиды с необлученной цитоплазмой (облучение спермия) и ранние зародыши с полностью инактивированными ядрами (облучение обеих гамет). Гаплоидные зародыши первую половину эмбрионального развития проходят нормально, а безъядерные зародыши останавливают свое развитие на стадии бластулы.

Сравнение изменений активности различных белков в развитии этих вариантов позволяет выяснить роль ядер в этом процессе. Оказалось, что такая сложная и зависимая от десятков ферментов функция, как дыхание, тесно связана с ядром и контролируется им в периоды его активности почти непосредственно [63]. В то же время активность одного из дыхательных ферментов - цитохромоксидазы связана с ядром в значительно меньшей степени [64]. Рост активности этого фермента определяется ядрами только в самый начальный момент развития, а далее происходит почти независимо от ядерной функции. Наконец, активность третьего фермента - катепсина в раннем развитии совсем не зависит от непосредственной функции ядер [65]. Очевидно, синтез м-РНК происходит в яйце еще в процессе оогенеза и далее белковый синтез может осуществляться независимо долгое время, до тех пор пока ядерный контроль не станет необходимым.

Классическим примером синтеза белка без непосредственного генетического контроля в клетках взрослого организма является синтез гемоглобина в безъядерных ретикулоцитах [45, 66]. Однако безъядерный синтез в ретикулоцитах является заключительным этапом длительного процесса дифференцировки, который затрагивает скорее не клетки по отдельности, а организм в целом. Мы уже отмечали, что в раннем эмбриональном развитии синтезируется гемоглобин F, состоящий из полипептида α и полипептида γ. К концу эмбрионального развития этот гемоглобин вытесняется гемоглобином А, который состоит из двух полипептидов α и β. Генетически это выражается в том, что локус а функционирует все время, а функция локуса у сменяется локусом β. Хотя гены β и γ располагаются в разных локусах, их активности проявляются не совсем независимо друг от друга. Это видно уже из того, что активность одного из них уменьшается постепенно, по мере увеличения активности другого, а при некоторых наследственных заболеваниях, когда ген β не функционирует, гемоглобин и у взрослых людей образуется с участием полипептида γ, т. е. недостаток в полипептиде β активирует ген γ [52]. Существенно, что все эти процессы происходят не в ходе дифференцировки клетки, а в ходе развития организма: на ранних стадиях развития все кровяные клетки красного ряда синтезируют полипептид γ, а у взрослого организма в эритробластах с самого начала их дифференцировки функционирует ген β. Следовательно, фактор, определяющий функцию того или другого гена, надо искать не внутри клетки, а во внутренней среде организма.

Таким образом, мы переходим от обсуждения механизмов регуляции белкового синтеза на клеточном уровне к механизмам регуляции на уровне организма. Факторами такой регуляции являются гормоны и влияния, осуществляемые через нервную систему. В качестве примера гормональной индукции белкового синтеза можно привести синтез казеина в молочной железе млекопитающих или овоальбумина в яйцеводе птиц под влиянием лактогенного или гонадотропного гормонов. Примером нервной регуляции может служить синтез белка в таком классическом для исследователей высшей нервной деятельности объекте, как слюнная железа. Однако внутриклеточные механизмы этих процессов известны очень мало. В последние годы получены данные о том, что актиномицин блокирует действие гормонов; это рассматривается как доказательство прямого влияния гормонов на первичное звено - синтез м-РНК. Однако вряд ли эти данные могут действительно доказать прямое взаимодействие гормонов с хромосомами, так как очевидно, что блокирование белкового синтеза на любом уровне (действие на синтез аминокислот, источники энергии, рибосомы и т. д.) привело бы к тем же результатам.

Более прямые доказательства действия гормонов на хромосомном уровне и подход к выяснению механизма такого действия содержатся в работе Клевера по влиянию гормона окукливания насекомых - экдизона на образование пуфов в гигантских хромосомах слюнных желез дрозофилы [67]. Пуфы - характерные вздутия на гигантских хромосомах - являются морфологическим проявлением активности отдельных генов, т. е. каждый из них соответствует усиленному синтезу по крайней мере одного белка. Расположение пуфов специфично для каждой стадии личиночного развития и закономерно меняется при переходе от стадии к стадии. Введение экдизона значительно ускоряет окукливание, которое начинается даже у личинок ранних возрастов. Соответствующие изменения происходят и в ядрах клеток слюнных желез. Уже через 15 мин. после введения гормона появляется новый пуф, характерный для начала окукливания, а еще через 2 часа - целая серия новых пуфов. Можно предполагать, что первый пуф появляется в результате прямого действия экдизона на этот локус хромосомы, который является геном-регулятором для остальных локусов, обеспечивающих процесс развития. Однако у нас нет других доводов в пользу этого предположения, кроме краткости времени, которое необходимо для проявления этой реакции. Возможно, что гормон в действительности вызывает или, наоборот, блокирует синтез другого вещества, которое имеет специфическое сродство с данным хромосомным локусом или что образование других пуфов просто происходит медленнее, но вне связи с появлением первого пуфа.

Однако независимо от того, стоят ли между экдизоном и локусами хромосом, активирующимися при окукливании, другие вещества-посредники, или он действует непосредственно, строение этого гормона содержит информацию не только для активации хромосомных локусов, но и для специфического воздействия именно на эти, а не на какие другие из многих тысяч генов.

Усиление или ослабление белкового синтеза, по-видимому, возможно на различных уровнях, в том числе и на таких неспецифических, как снабжение аминокислотами или источниками энергии. При общем или аминокислотном голодании синтез белка, естественно, замедляется. Возможно, что регуляция белкового синтеза осуществляется и на уровне рибосом. Моделью такой регуляции может быть действие малых концентраций актиномицина, которые, как показали Георгиев и Лерман, подавляют в первую очередь синтез рибосомной РНК [68]. Очевидно, что нехватка в образовании рибосом должна сказаться на синтезе белка; но произойдет это, конечно, не сразу, и у нас нет никаких доказательств, что этот механизм играет в неповрежденных клетках какую-либо роль.

Основное значение, особенно для решения проблемы передачи информации от генов к признакам, имеет регуляция белкового синтеза на начальном, хромосомном уровне, когда возможна избирательная активация отдельных генов, а следовательно и стимуляция синтеза отдельных белков и изменение определенных звеньев метаболизма. Изучение именно этого механизма и есть основная задача - ключ для решения всей проблемы.

4. Метаболизм небелковых соединений

Если рассматривать белки как единственное звено, через которое реализуется наследственная информация, то все многообразие признаков должно быть сведено к реакциям, катализируемым белками-ферментами, или функциям, которые осуществляются структурными белками. Все данные, имеющиеся в настоящее время, приводят именно к такому заключению. Однако прежде чем перейти к рассмотрению некоторых примеров, характеризующих следующую ступень реализации наследственной информации - белковый контроль над небелковым метаболизмом, мы должны упомянуть о двух гипотетических возможностях наследственной передачи признаков без специфического белкового синтеза. Первая из них - передача наследственных свойств с ДНК прямо на высокомолекулярные небелковые соединения типа полисахаридов и липидов и вторая - передача наследственной информации, минуя ДНК, прямо со структуры на структуру. Вторую возможность, которая скорее относится к генетическому контролю над внутриклеточными структурами - гранулами и оболочками, мы рассмотрим в следующем разделе, специально посвященном этой проблеме. Что же касается первой возможности, то единственным аргументом в пользу ее обсуждения являются те трудности, может быть мнимые, которые сейчас возникают при попытке объяснить синтез сложных небелковых молекул чисто ферментативным путем.

Полисахариды представляют собой сложные, часто разветвленные цепочки, каждое звено которых представлено одним из многих видов Сахаров [69, 70]. Говоря о сложности их строения, мы в меньшей степени имеем в виду такие соединения, как крахмал и гликоген, молекулы которых хотя и достигают гигантских размеров (имеют молекулярный вес до 2⋅10⁸), но построены относительно просто, поскольку представлены, как правило, одним видом Сахаров. Синтез их в принципе возможен при участии всего двух видов ферментов: D-энзима, обеспечивающего линейное присоединение Сахаров, и Q-энзима, создающего ветвление полисахаридной цепочки. Строение этих полисахаридов, по-видимому, мало специфично, так как ветвление и длина отрезков цепочек в известной степени определяются случайно. Для функции этих полисахаридов в качестве запасных веществ достаточно их высокой полимерности, обеспечивающей малую растворимость и плотность упаковки. Однако роль других Сахаров сложнее, и это должно накладывать более жесткие требования к специфике их строения. Особенно сложны такие комбинированные соединения, как мукополисахариды, гикопептиды и гликолипиды (некоторые из них содержат к тому же аминокислоты). Во многих гликопептидах одновременно присутствуют различные сахара (к настоящему времени известно более ста различных олигосахаров). Так, в одном из гликопептидов с молекулярным весом 10⁶ после действия трипсина остаются остатки цепи с молекулярным весом 10⁴, содержащие галактозу, маннозу, фруктозу, глюкозамин и сиаловую кислоту. При этом показано, что соединение полисахаридной и полипептидной частей осуществляется конец в конец, т. е. образует чередующуюся цепочку. Из туберкулезных палочек выделен сложный гликолипид, или, вернее, гликолипопепид с молекулярным весом 5400, содержащий сахара (арабинозу, галактозу, маннозу и аминосахара), аминокислоты (аланин, глютамин и диаминопимелиновую кислоту) и жирные кислоты с цепочками, содержащими 16-20 углеродных звеньев [71].

Чисто липидные соединения не являются полимерными, но сложность их строения может увеличиваться за счет различной длины цепи жирных кислот, степени их ненасыщенности и положения двойных связей. У животных основная масса жиров синтезируется из немногих жирных кислот (стеариновой, пальмитиновой, линолевой), но у бактерий и растений жирные кислоты более разнообразны. Если учесть, что свойства триглицеридов зависят от того, в α- или в β-положении находится та или иная жирная кислота, то количество возможных триглицеридов даже из четырех жирных кислот будет около 30. Действительное же разнообразие липидов намного больше, причем не только за счет разнообразия жирных кислот, но и за счет образования полиглицерофосфатов, имеющих полимерное строение, и соединений глицеридов с полипептидными и полисахаридными цепями. Так, например, из мозга овцы были выделены липополисахариды, содержащие глицерин, жирные кислоты и жирные спирты, холин, этиламин, глюкозу, а также ряд неидентифицированных соединений.

О механизме синтеза таких сложных соединений известно очень немного [72]. Характерно, что первым этапом этого процесса, как и в случае белкового синтеза, является фосфарилирование посредством АТФ или чаще ЦТФ. Известен ряд энзимов, катализирующих специфическое соединение определенных Сахаров: d-маннозы и α-галактозы, мелибиозы и глюкозамина и др.

Однако вместе с тем известны и энзимы, полимеризующие сахара не специфично. В искусственных условиях можно синтезировать полисахаридные цепи, содержащие более 1000 членов, которые, однако, располагаются случайно. Эти примеры не могут служить доказательством неспецифического синтеза полисахаридов в клетке, так как полимеры со случайным расположением членов могут быть созданы также из аминокислот или нуклеотидов, хотя очевидно, что этот процесс не имеет ничего общего со строго специфичным механизмом синтеза белков или нуклеиновых кислот в клетке.

Основной вопрос, который должен быть решен, - это вопрос о степени специфичности полисахаридов и липидов. Если будет показано, что эта специфичность не очень велика, то это будет означать, что, как в случае гликогена и крахмала, их синтез не требует большого количества специфичных энзимов. Если строение хотя бы некоторых соединений детерминировано так же строго, как последовательность аминокислот в белках, то количество ферментов со строгой специфичностью действия должно быть так велико, что возникнет вопрос о недостаточном количестве генов у низших организмов. Действительно, исходя из размеров трансформирующих единиц ДНК и ее количества в бактериях, число генов у них не должно превышать 2-3 тысячи [58, 73, 74]. При условии, что все они обеспечивают синтез специфических ферментов (что заведомо неверно, так как часть ДНК должна быть ответственна за синтез структурных белков и часть за регуляцию генетической функции), этого количества должно быть достаточно для обеспечения всех этапов синтеза небелковых соединений. Трудно представить энзиматический синтез строго детерминированной последовательности членов в полисахаридах и липидах с участием менее чем 20-100 ферментов. Поскольку количество этих соединений явно не менее 100, проблема недостатка генов кажется вполне реальной. Все эти трудности исчезнут, если предположить, что информация о строении полисахаридов и липидов записана не в виде набора энзимов, а в отдельных генах и их синтез осуществляется на матрицах по тем же принципам, что и синтез белка. Естественно, что такой способ записи информации, когда структура одной молекулы кодируется одним геном, гораздо компактнее, чем когда эта же молекула требует для своего синтеза создания десятков или сотен энзимов, т. е. десятков и сотен генов. Некоторым аргументом в пользу рассматриваемой гипотезы является и тот факт, что липиды синтезируются всегда в частицах - митохондриях и микросомах, причем удельная активность микросом выше, чем митохондрий. Следовательно, как и синтез белка, синтез липидов связан со структурами, содержащими РНК.

Высказывалось предположение о том, что матрицей для синтеза, в частности, полисахаридов, могут служить они сами. Действительно, показано, что синтез гликогена in vitro требует присутствия "праймера" - затравки из гликогена. Однако уже указывалось, что синтез гликогена и крахмала не может служить моделью для соединений более сложного строения. Признание такого механизма означало бы, что строение липидов и полисахаридов не контролируется генетическим аппаратом клетки и передается от поколения к поколению через сами эти соединения, т. е. через цитоплазму. Это плохо согласуется с тем, что, например, полисахариды оболочек бактерий являются обычным генетическим признаком и передаются от штамма к штамму при помощи трансформирующей ДНК. Исходная культура пневмококков может быть вообще лишена полисахаридной капсулы и приобретает ее в результате включения трансформирующей ДНК. Матрицы этих соединений до трансформации, естественно, не могло быть, такой матрицей является только ДНК. Более того, при трансформации обычно передается только один признак, передача двух - крайне редкое событие. Если включение в генотип бактерии одного дополнительного гена способно обеспечить появление полисахаридной капсулы, то это может быть объяснено лишь двумя способами. Первый основан на том, что оба штамма бактерий отличались до трансформации крайне незначительно и, во всяком случае, содержали все необходимые ферменты для построения специфического полисахарида бактериальной капсулы. У штамма, лишенного капсулы, видимо, отсутствовал лишь один белок и привнесение гена, который этот белок определял, оказалось достаточным для построения капсулы. Это предположение трудно обосновать, если речь идет о различных существующих в природе штаммах бактерий, так как трудно представить, что один из них хранил целый набор нефункционирующих генов, необходимых для построения несвойственной этому штамму капсулы. Второе объяснение состоит в том, что вся основная информация о полисахаридной капсуле содержится в трансформированном гене и одного специфического фермента для построения капсулы явно недостаточно; остается признать, что в ДНК содержится информация о строении полисахарида, которая реализуется не через синтез белка.

Тем не менее предположение о прямой передаче информации с ДНК, минуя стадию белков, на сложные небелковые соединения, остается пока совершенно гипотетичным. Дальнейшие исследования степени детерминированности этих сложных высокомолекулярных небелковых соединений и путей их синтезу позволят решить поставленную здесь проблему.

Исследования генетического контроля метаболизма происходили не параллельно исследованиям самого метаболизма, поэтому одни метаболические циклы исследованы в генетическом отношении достаточно подробно, другие, часто более важные, генетически совсем не изучены. Это объясняется требованиями, которые предъявляет к объекту биохимическая генетика. Почти все основные исследования были сделаны на микроорганизмах, и прежде всего на нейроспоре. Только отдельные признаки, такие, как окраска цветков, содержание витаминов в кукурузе, меланина в шерсти морских свинок, гемоглобины человека явились исключением из этого правила.

Но и у микроорганизмов далеко не все звенья обмена оказались равно доступными. Большее внимание было уделено признакам, позволяющим вести отбор: потребности в определенных предшественниках и способности к усвоению различных веществ. Еще более удобным генетическим признаком является нечувствительность к различным ядам (антибиотикам). Однако метаболическое значение этих последних свойств обычно невелико и сводится к синтезу ферментов, разрушающих яд (пенициллаза, например). Поэтому генетически лучше всего оказались исследованы процессы синтеза аминокислот, пуринов и пиримидинов, и значительно меньше энергетический обмен, хотя в обычной биохимии ему уделяется большее внимание.

Сейчас известно чрезвычайно много генов, блокирующих отдельные звенья метаболизма [8]. Однако не всегда обнаружение мутанта, у которого цепь метаболизма оборвана в том или ином звене, означает, что мутировал ген, ответственный за фермент, катализирующий данную реакцию. Действительные отношения могут оказаться сложнее: процесс может быть двух- и более ступенчатым и его контролирует соответствующее число энзимов и генов. Мутации могут затрагивать субстраты исследуемой реакции, влияя на их проницаемость, включение в конкурентные реакции и т. д. Могут образовываться вещества, ингибирующие реакцию, и, наконец, блокирование фермента может быть связано с изменением не структурного цистрона, а генов, регулирующих его активность. Так, например, триптофан у нейроспоры синтезируется путем конденсации индола и серина под контролем триптофансинтетазы. Поэтому большинство линий нейроспоры, у которых обнаружен этот фермент, не нуждаются в триптофане. Однако есть несколько линий, требующих для своего роста триптофан; это дает основание полагать, что у них мутировал именно ген, образующий триптофансинтетазу. Однако действительные отношения оказались сложнее [75, 76]. Мутанты, обозначенные С83 и У1952, нуждаются в триптофане, и их экстракты не способны синтезировать его из индола и серина, т. е. лишены триптофансинтетазы. Однако существует ген - супрессор su-У1952, который подавляет активность гена У1952, но не С83. При наличии его в генотипе мутанты У1952 способны расти без триптофана, а мутанты С83 - нет. Объяснение этих данных может быть связано с наличием не одной, а двух последовательных реакций, ведущих к конденсации индола и серина, причем мутации У1952 и su-У1952 могут быть связаны с изменениями не структурного гена, а гена-регулятора. В то же время показано, что активность триптофансинтетазы может сильно меняться под влиянием других генов (например, мутаций, определяющих потребность в гистидине), от стадии роста культуры и др. [77].

В настоящее время известны пути синтеза большинства низкомолекулярных компонентов метаболизма, но не все организмы способны к этим синтезам. Некоторые микроорганизмы способны расти на чрезвычайно простой среде, содержащей только необходимые элементы и вещества с высоким энергетическим потенциалом. Другие организмы нуждаются в тех или иных аминокислотах, витаминах и других соединениях. Наконец, и в отношении источников энергии, используемых организмом, существует большое разнообразие. Каждое звено метаболизма определяется деятельностью определенных ферментов и, следовательно, чем меньше требований организм предъявляет к химическому составу среды, тем больший набор ферментов он должен содержать сам. Значительная часть ферментов связана с определенными структурами - митохондриями, эргастоплазмой, клеточными оболочками, ядром, и их деятельность требует создания определенных условий и согласования с деятельностью других ферментов. Все это означает, что разнообразие путей и возможностей метаболизма вместе с преимуществами, которые это дает, накладывает и определенные ограничения, вероятно выражающиеся прежде всего в интенсивности каждой из возможных функций. В эволюции эти противоречивые тенденции приводят к тому, что в генотипах сохраняется информация только о белках, обеспечивающих те метаболические процессы, которые действительно необходимы и не могут быть компенсированы поступлением этих веществ из среды. У многоклеточных животных, способных к активному питанию, эта эволюционная экономия выражается в том, что организм способен к синтезу только аминокислот, которые в нормальных условиях поступают из внешней среды в недостаточном количестве. Выбор тех аминокислот, которые организм способен создавать сам, диктуется не только их содержанием в пище, но и сложностью их синтеза. Отражением этого является тот факт, что количество ферментов, необходимых для синтеза "незаменимых" аминокислот, намного выше количества ферментов, которые необходимы для синтеза остальных аминокислот. Это, очевидно, относится и к другим соединениям, таким, как витамины, которые синтезируются в организме растений и многих микроорганизмов, но у млекопитающих должны поступать извне. Очевидно, "риск", связанный с возможностью авитаминозов, меньше тех "расходов", которые потребовало бы создание соответствующего собственного синтетического аппарата.

У многоклеточных экономия метаболических путей достигается еще и за счет специализации тканей и клеток. Так, если организм млекопитающих нуждается всего лишь в 12 аминокислотах, то его отдельные клетки в культуре нуждаются почти во всех 20. Синтез аминокислот, следовательно, происходит не в каждой клетке, а только в определенных тканях, специализированных для этой функции, а именно в печени. В генетическом отношении такая специализация выражается в том, что большинство генов в каждой отдельной клетке являются заблокированными и функционируют только те, которые необходимы именно для данной ткани. У микроорганизмов зарепрессированными остаются только гены, определяющие синтез индуцируемых ферментов, субстраты которых отсутствуют. Доля таких не используемых в каждый данный момент генов, очевидно, меньше, чем доля генов, не используемых в каждом типе специализированных клеток у высших организмов.

Однако сумма всех видов метаболических процессов у микроорганизмов, по-видимому, не намного меньше, чем у многоклеточных, в то время как содержание ДНК на клетку у них значительно ниже. Надо полагать, что это увеличение генетического аппарата в эволюции связано с процессами дифференцировки.

Неудивительно, если окажется, что у высших организмов на каждый структурный ген, обеспечивающий одно звено метаболизма, имеется несколько генов, регулирующих его функцию в процессах развития и дифференцировки.

Генетический контроль над метаболизмом осуществляется не только посредством синтеза специфических белков - ферментов, но и посредством регуляции этого синтеза, поскольку выбор путей обмена зависит от того, какова активность тех или иных генов. Примером такой регуляции являются взаимоотношения типа индуцированного синтеза, когда включение или выключение гена регулируется присутствием или отсутствием субстратов. Однако этот и другие генетические механизмы не могут обеспечить необходимой степени регуляции обмена, и ряд метаболических процессов, вероятно большинство их, регулируется, помимо генетического аппарата, и в цитоплазме клетки. Примером сложной системы внутриклеточной, но внеядерной регуляции, являются взаимоотношения между гликолизом, дыханием и окислительным фосфорилированием в митохондриях и гиалоплазме. Скорости этих процессов зависят от концентрации АТФ и АДФ, которые в то же время являются продуктом и субстратом ряда реакций, связанных с фосфорилированием [78]. Это обеспечивает необходимую для каждого регулирования обратную связь. Так, например, увеличение концентрации АДФ усиливает интенсивность дыхания и сопряженного с ним фосфорилирования. В результате фосфорилирования АДФ превращается в АТФ, концентрация АДФ падает и интенсивность дыхания уменьшается, иными словами, между АДФ и дыханием существует связь: больше АДФ - больше дыхания (прямая связь), больше дыхания - меньше АДФ (обратная связь). Однако регуляция энергетических процессов может осуществляться и ядром за счет изменения количества ДПН (НАД), синтезируемого в ядре.

Вторым примером саморегулирования метаболизма служит явление аллостерического ингибирования, которое состоит в том, что конечный продукт цепи реакций тормозит действие фермента, стоящего в начале этой цепи [79, 80]. Чем больше конечного продукта, тем медленнее работает вся цепь его синтеза, и концентрация конечного продукта тем самым выравнивается. Механизм этого процесса основан на том, что фермент, стоящий в начале метаболической цепи, имеет не один, а два активных центра - один, обеспечивающий его основную реакцию, и второй, специфически связывающийся с конечным продуктом. Степень сродства к этим двум веществам и определит скорость синтеза во всей цепи.

Последний вопрос, который следовало бы рассмотреть в этом разделе, - это вопрос о "количестве генного действия". Еще недавно в литературе часто говорилось о большей или меньшей активности генов; этими терминами часто объясняется доминирование, а иногда прямо указывается, что речь идет об интенсивности образования генопродуктов [8].

В некоторых случаях действительно количественные различия в эффекте двух генотипов объясняются количеством генов. Таковы все примеры, в которых количество или частота появления признака зависят от того, находится ли данный ген в обеих гомологичных хромосомах (гомозиготность) или только в одной. У растений эндосперм семян образуется под контролем трех наборов хромосом и поэтому возможно присутствие одного, двух или всех трех одинаковых генов. Так, в эндосперме кукурузы количество витамина А зависит от генов У; если при генотипе yyy количество витамина выражается числом 0,05, то генотипы yyY, yYY и YYY дают соответственно значения: 2,25; 5,00; 7,50; т. е. количество витамина отражает почти точно независимую активность каждого гена [81]. Подобным же образом в зависимости от количества соответствующих генов меняется количество сахаров, крахмала, других витаминов [82].

Аналогичные количественные отношения обнаруживаются и для многих аллельных генов, когда степень выражения какого-либо признака (часто количество вещества) может меняться. Мы уже приводили ряд таких генов для локуса ci (жилкование крыльев дрозофилы); известен также ряд генов bobbed, определяющих у дрозофилы длину щетинок [83]. Следует напомнить также про ряд генов С, ответственных за количество меланина в шерсти морских свинок [9, 84]. Кроме гена С, дающего нормальное количество меланина (100%), известны его мутанты c^k, c^d, c^r и с^g, которые в диплоидном состоянии обеспечивают соответственно (в % от контроля) 88, 31, 12 и 0 меланина. Зная эти цифры, можно теоретически предсказать содержание меланина в шерсти животных при всех возможных гетерозиготных комбинациях этих генов. Предсказание хорошо согласуется с экспериментом и кроме вывода о независимом действии аллельных генов позволяет сделать вывод о разной активности генов серии С. Возникает вопрос, отличается ли один аллель от другого только количеством синтезируемого генопродукта (одинакового для всех аллелей) или речь должна идти о различном качестве генопродуктов, синтезируемых разными аллелями. До тех пор пока понятие генопродукт не было расшифровано (генопродуктом можно было бы считать сам меланин), такая постановка вопроса не имела смысла, но сейчас, когда генопродуктом мы должны называть м-РНК или в крайнем случае фермент, мы вправе его поставить.

Различия в количестве м-РНК, образуемого соответствующим геном, вызванные мутационным путем, в принципе возможны. Мутация может затронуть гены, ответственные за регуляцию функции гена С. Если же рассматриваются действительные мутации структурного гена, то они могут касаться только изменений нуклеотидной последовательности ДНК, т. е. приводить к изменениям первичной структуры полипептида, а не скорости его образования. Изменение первичной структуры (аминокислотной последовательности) может выразиться в изменении скорости реакций, которые этим ферментом катализируются. Мы хорошо знаем, что замена отдельных аминокислот нередко вообще не сказывается на энзиматической активности и, очевидно, может изменять ее только частично. Наконец, скорость реакции может зависеть от изменений фермента, которые не уменьшат непосредственно скорости основной реакции, но увеличат аллостерическое сродство к конечному продукту. Тогда уже маленькая концентрация этого продукта (например, меланина) может привести к сильному замедлению активности фермента. Таким образом, различия между аллельными генами одного количественно отличающегося ряда, как правило, будут состоять не в количестве генопродуктов, а в разных скоростях реакций, о которых, писал еще Гольдшмидт [20, 30].

5. Генетический контроль над внутриклеточными структурами и клеточной поверхностью

Первым надмолекулярным уровнем организации в клетке являются внутриклеточные структуры, которые играют определяющую роль в создании общего плана метаболизма и направлении его путей. В предыдущих разделах мы пытались представить всю совокупность наследуемых признаков как отражение набора ферментов, специфические свойства которых однозначно определяются функционирующими генами. Однако а действительности свойства клеток в такой же степени зависят от ее надмолекулярной организации, как и от свойств самих молекул. Может показаться, что такое разделение искусственно и структурная организация может быть сведена к свойствам молекул, из которых она построена, а значит гены, однозначно определяющие строение молекул в клетке, также однозначно определяют и надмолекулярные структуры. Это было бы так, если бы удалось во всех случаях доказать, что внутриклеточные структуры могут создаваться заново сами собой при сочетании всех химических компонентов клетки.

Однако информация о взаимном расположении этих молекул, по-видимому, не всегда содержится в свойствах самих молекул и должна предсуществовать или быть привнесенной извне. Как будет показано в этом разделе, внутриклеточным структурам действительно свойственна некоторая относительная автономность, и вопрос о роли генотипа в их образовании и функции является одним из актуальных, но мало разработанных вопросов.

Все многообразие внутриклеточных структур, кроме хромосом, может быть сведено к двум топологическим образованиям - гранулам и мембранам. При этом оказывается, что крупные гранулы, такие как митохондрии и хлоропласта, сами состоят из мембран и, по-видимому, истинными гранулами являются только рибосомы, стоящие на грани молекулярной и надмолекулярной структур [85, 86].

Мембраны, как известно, состоят из трех слоев - двойного слоя ориентированных липидных молекул, заключенного между двух слоев белковых молекул. Во многих случаях, например в митохондриях, на мембранах адсорбированы глобулярные молекулы белка, митохондриальные ферменты, функции которых регулируются и сопрягаются друг с другом их фиксированным положением на мембране. Из мембран складываются все основные структуры клетки: оболочка ядра и плазматическая мембрана всей клетки, эргастоплазматические полости и каналы, митохондрии, хлоропласта и другие пластиды растений, структуры Гольджи, вакуоли одноклеточных и т. д. Многие из них (митохондрии, пластиды, эргастоплазмы) содержат также гранулярные элементы - рибосомы. Плохо изучено строение таких важных и своеобразных структур одноклеточных, как базальные тельца ресничек - кинетобласты и жгутиков - блефаропласты, а также образования, стоящие на грани клеточных органелл и эндоплазматических паразитов - каппа-частицы. Блефаропласты и каппа-частицы содержат ДНК, которую в последние годы находят также в хлоропластах и в митохондриях.

1) Ядрышко

Генетический контроль в наиболее четкой и прямой форме показан для ядрышка, образование которого индуцируется специальными участками хромосом [87]. Локализация этих участков может быть точно определена и на ряде объектов (хирономус, дрозофила, амфибии) получены гибриды (разумеется, летальные), лишенные ядрышек [88, 89].

2) Ядерная мембрана

Происхождение ядерной оболочки разными авторами описывается различно. В сперматидах насекомых, а также в клетках растений (конские бобы) хромосомы в телофазе окружены мембранами, которые при образовании интерфазного ядра сливаются в одну ядерную оболочку [90, 91]. В то же время в клетках саркомы оболочка ядра образуется в поздней телофазе из цитоплазматических мембран [92].

Рассматривая вопрос о происхождении ядерной мембраны, следует сказать несколько слов о ее свойствах, которые непосредственно связаны со взаимоотношениями ядра и цитоплазмы, т. е. о ее проницаемости [93]. Данные об этих свойствах ядерной мембраны противоречивы и, очевидно, отражают сложную и высокоспецифическую избирательную проницаемость этой структуры. На электронных снимках в ядерной мембране можно заметить множество "отверстий", которые обычно ведут в каналы и цистерны эргастоплазмы, а иногда даже как бы непосредственно сообщаются с внешней средой. В то же время вращение ядра в клетке, которое легко видеть при цейтраферной киносъемке, свидетельствует о непрочном характере этих связей [94]. Различия ионного состава ядра и цитоплазмы указывают на способность избирательно пропускать даже отдельные заряженные атомы. Вместе с тем многие высокомолекулярные вещества относительно легко проникают в ядра. В первую очередь это относится к белкам, причем наблюдается высокая проницаемость для белков ядерного происхождения и непроницаемость для цитоплазматических белков. Так, при пересадке к амебе дополнительного ядра из другой амебы, выросшей на среде с мечеными аминокислотами, можно видеть, что значительная часть меченых ядерных белков быстро переходит из одного ядра в другое. В ядро быстро проникают ядерные белки - протамины и гистоны [95]. В то же время такие белки, как глобулины и альбумины, в ядро не проходят [96]. Было отмечено, что через ядерную мембрану легко проходят такие крупные частицы, как макромолекулы РНК и, по-видимому, целые рибосомы.

3) Эргастоплазма

Эргастоплазматические структуры связаны с ядром не только морфологически. Их основной компонент - рибосомы - имеют, несомненно, ядерное происхождение. Процесс образования эргастоплазматических мембран, по-видимому, тесно связан с ядром. Во всяком случае, морфологически новые структуры в дифференцирующихся клетках возникают в непосредственном контакте с ядром. Такого рода случаи тщательно описаны Уоддингтоном на примере дифференцировки клеток хорды и зрительных клеток у дрозофилы [97]. Во многих малодифференцированных клетках можно обнаружить в значительном количестве рибосомы, не связанные с видимыми структурами [98]. И только в процессе дифференцировки возникают упорядоченные эргастоплазматические структуры, к стенкам которых прикрепляются рибосомы. Подобное увеличение эргастоплазмы наблюдается и при многих других дифференцировках - нервных клеток у куриных зародышей [99], превращении интерстициальной клетки гидры в книдобласт [100], при формировании желез и т. д.

Эргастоплазма легко испытывает обратное развитие при дифференцировке и даже во время митотического деления [101], хотя в последнем случае значительная часть структур в том или ином виде все же сохраняется в цитоплазме делящихся клеток [102]. Все это указывает на то, что эргастоплазма может возникать заново, по-видимому, под контролем ядра, а возможно, и при его непосредственном участии.

4) Митохондрии

О связи митохондрий и ядра еще в недавнее время существовало много гипотез, в которых высказывались предположения о происхождении митохондрий прямо из ядра или по крайней мере из ядерной мембраны. В последнее время были получены, однако, новые факты, подтверждающие старые наблюдения о том, что митохондрии не возникают de novo, а образуются прямым делением и, в этом смысле, не зависят от ядра. В частности, в работе Лака митохондрии прочно метились радиоактивным холином. Дальнейшее наблюдение над растущими клетками нейроспоры показало, что при увеличении числа митохондрий метка равномерно распределяется между всеми митохондриями [103]. Процесс увеличения числа митохондрий заключается, следовательно, в их росте и делении. Деление митохондрий удавалось также наблюдать на живых клетках при микрокиносъемке.

Важным также является вопрос о происхождении митохондриальных белков: образуются ли они, как и все прочие белки, при синтезе в рибосомах на матрице РНК, имеющей ядерное происхождение, или белки митохондрий синтезируются в них самих на собственной матрице и относительно независимы от ядра. В пользу последнего предположения свидетельствуют многочисленные опыты по включению меченых аминокислот в митохондриальные белки. Нами было показано, что в изолированных митохондриях увеличивается активность цитохромоксидазы и этот процесс подавляется пуромицином, т. е. является белковым синтезом [104]. Данные опыты не позволяют решить вопрос о происхождении матрицы, на которой синтезируются эти белки, поскольку неясно, образуются ли они каждый раз в ядре и долгое время сохраняются внутри митохондрий, или каким-то образом способны к редупликации в самих митохондриях при их делении. Однако недавно были получены данные о частичном подавлении включения аминокислот в митохондрии актиномицином Д, что предполагает в них не только синтез белка, но и синтез м-РНК [105]. Этот факт был подтвержден и нами.

В уже цитированной работе Мирского и сотр. [55] показано, что действие актиномицина Д продолжительное время не проявляется на ферментах митохондрий. Надо, однако, учесть, что эти опыты ставились на неделящихся клетках, где обновление митохондриального состава идет относительно медленно (в клетках печени, например, средний срок жизни митохондрий - 10 суток). Автономность митохондрий была установлена также в работах Эфрусси на дрожжах, у которых был получен штамм с недостатком дыхательных ферментов, причем это свойство не зависело от генетического аппарата клетки, а передавалось вместе с цитоплазмой [106]. Митохондрии являются генетически непрерывными структурами и у многоклеточных животных. При редукционном делении во время сперматогенеза митохондрии делятся и равномерно распределяются между сперматогониями [107]. "Женские" митохондрии поступают в зародыш вместе с цитоплазмой яйца, а "мужские" вносятся в яйцо вместе со спермием. Однако судьба этих митохондрий, попавших в цитоплазму яйца со спермием, точно не известна, следовательно, не известна и роль этого процесса [108]. Нами было установлено, что роль мужской и женской половых клеток в росте активности специфического митохондриального энзима - цитохромоксидазы одинакова и что радиационная инактивация ядер после оплодотворения не способна остановить увеличение активности этого фермента [104].

Все эти факты свидетельствуют о большой автономности митохондрий и, может быть, о их самостоятельном генетическом значении. Вместе с тем выше уже говорилось, что такие важные для функций митохондрий коферменты, как НАД (ДПН), определенно синтезируются в ядре [109].

Гарвей центрифугировала яйцо морского ежа так, что основная масса митохондрий концентрировалась на одном полюсе, который затем отрывался от яйца. Тем не менее в оставшейся "безмитохондриальной" части яйца начиналось нормальное развитие и появлялись митохондрии [110]. Правда, в последнее время эта работа была критически рассмотрена и было найдено, что данным методом не удалось достигнуть полного удаления митохондрий [111].

В процессе клеточной дифференцировки митохондрии претерпевают значительные изменения формы и, по-видимому, функции. Их количество, размеры, отношения длины к ширине, внутренняя структурированность, активность сцепленных с ними ферментов различны в разных тканях, и в эмбриогенезе можно наблюдать, как дифференцировка всех клеточных свойств сопровождается соответствующими изменениями в митохондриях. Поскольку генетический контроль дифференцировки не вызывает сомнений, то надо полагать, что и изменения митохондрий в ходе развития контролируются ядром. Механизм этого процесса пока неизвестен.

Подводя итог сказанному, можно заключить, что митохондрии являются относительно автономными структурами. Они способны к синтезу белка, росту и размножению делением. Однако не известно, все ли белки, входящие в состав митохондрий, синтезируются в них самих и является ли деление митохондрий во всех случаях и у всех объектов единственным способом увеличения их количества. Генетический аппарат клетки, во всяком случае в некоторых отношениях, осуществляет контроль над функцией митохондрий и их изменениями в развитии. Возможно и очень вероятно, что хотя белковый синтез и происходит в митохондриях, но информация об этих белках доставляется в митохондрии из ядра, через м-РНК. Однако это должна быть очень стабильная м-РНК, вследствие чего митохондрии способны длительное время функционировать без ядерного контроля. Примером являются митохондриальноподобные структуры в безъядерных ретикулоцитах [112].

5) Пластиды растений

Хлоропласты по своему строению, функции и отношению к генетическому контролю очень напоминают митохондрии, хотя, естественно, имеют много специфических особенностей. Ряд важных положений, которые для митохондрий еще являются спорными, для хлоропластов доказаны с большой убедительностью. Хлоропласты, по-видимому, не способны возникать de novo: клетки одноклеточных водорослей, искусственно лишенные хлоропластов, остаются бесцветными во всех последующих поколениях [113, 114]. Процесс деления хлоропластов хорошо изучен [115]: он состоит в росте составляющих их мембран (молекулярный механизм роста не известен), которые затем перетягиваются посередине, образуя два новых хлоропласта. Вместе с тем известен ряд мутаций, влияющих на строение и свойства хлоропластов [116, 117]. Введение актиномицина блокирует синтез хлорофилла. Это означает, что синтез данного соединения контролируется белками, образование которых определяется хромосомами ядра. Иными словами, при всей автономности хлоропластов их белки полностью или частично контролируются обычным генетическим путем. Возможно, что единственным полностью автономным элементом митохондрий и хлоропластов окажется их структурная организация, т. е. взаимное специфическое расположение мембран, которое способно сохраняться при их росте и делении, но не может создаваться заново из составляющих их соединений.

6) Структуры одноклеточных

Особое место в проблеме автономности клеточных структур составляют гранулы одноклеточных: кинетобласты, блефаропласты и каппа-частицы. Этой большой и самостоятельной проблемы мы коснемся только кратко [118, 119]. Все эти частицы способны к размножению делением, что определенно доказано для ДНК-содержащих блефаропластов и каппа-частиц. В отношении кинетобласта этот вопрос еще не решен окончательно, так как возможно, что новые гранулы возникают не путем деления старых, а создаваясь рядом с ними. Однако вне связи с предсуществующими частицами новые никогда не возникают.

Кинетобласты дают начало ресничкам, и, хотя сами кинетобласты относительно автономны, антигенные свойства ресничек определяются ядром. У парамеций известны восемь неаллельных генов, которые могут определять антигенные свойства ресничек, но для каждого клона характерен только один антигенный тип, контролируемый одним из восьми генов [120], в то время как остальные семь генов у данного клона неактивны. Реснички как бы дифференцируются по своему белковому составу в одном из восьми возможных направлений. Это состояние "дифференцировки" передается из поколения в поколение, но не является строго детерминированным. Под воздействием смены внешних условий - температуры и других факторов - антигенный тип может измениться, т. е. попасть под контроль другого гена из восьми возможных. Новое состояние дифференцировки также сохраняется во многих поколениях, до тех пор пока новое внешнее воздействие не изменит его.

Каппа-частицы [121] часто рассматриваются как эндопаразиты парамеций: они размножаются делением, содержат ДНК и, естественно, не способны возникать заново. Каппа-частицы выделяют особое вещество - парамеции, которое убивает парамеций других клонов и тем самым обеспечивает их носительнице наследственный признак "киллер" (убийца). При некоторых искусственных условиях темп деления парамеций может превышать темп делений каппа-частиц, тогда через несколько делений количество каппа в парамециях уменьшается и, наконец, появляются особи, лишенные их вовсе. При этом они теряют способность быть "киллер" и дают начало новому клону, лишенному каппа. Однако при конъюгации с каппасодержащими особями при частичном обмене цитоплазмой достаточно хотя бы одной каппа проникнуть в парамецию, чтобы снова образовался клон "киллер". Но такое включение каппа-частиц возможно не в любую парамецию, а только в те из них, которые имеют ген К, в то время как его аллеломорф k не может обеспечить размножение каппа-частиц в цитоплазме. Следовательно, и для этих высокоавтономных частиц необходим некоторый генетический контроль со стороны ядра.

7) Оболочка клетки

Последняя важнейшая структура, которую мы должны рассмотреть - это клеточная оболочка, или плазматическая мембрана. Прямых доказательств генетического контроля над ее образованием мало. Известно, однако, что многие антигенные свойства локализованы в оболочках. Ферменты, контролирующие проницаемость, - пермеазы, локализованы в оболочках и определенно контролируются генетическим аппаратом клетки [40, 122]. Выше уже говорилось о генетическом контроле образования капсул у микроорганизмов. Белковый и полисахаридный состав клеточной оболочки, таким образом, контролируется ядром. В некоторых растительных клетках можно наблюдать как бы прямое участие ядра в построении оболочки. Образование новой клеточной стенки после деления сопровождается миграцией ядра к этой стенке.

Степень автономности клеточной оболочки как структуры, по-видимому, невелика, поскольку на месте разрушенной оболочки быстро возникает новая [123]. Впрочем, она может строиться от мест обрыва старой оболочки. У инфузорий, у которых клеточная оболочка представляет собой чрезвычайно сложное структурное образование [119], регенерация особи возможна из ничтожной части клетки (¹/₁₀-¹/₂₀₀), но до тех пор, пока сохранено ядро и обязательно хотя бы маленькая часть оболочки. Полное удаление последней неизбежно ведет к гибели организма.

Плазматическая мембрана обычных клеток у многоклеточных устроена проще: она, по-видимому, в значительной степени, если не целиком, определяется свойствами составляющих ее молекул и не требует для своего построения дополнительной информации или предшествующих структур.

Проницаемость и ее регуляция, несомненно, являются одним из важнейших функциональных свойств плазматических мембран, именно эти свойства в ряде случаев определяют ведущие функции специализированных клеток (например, фильтрация в почках, проведение возбуждения в нервном волокне). Однако, может быть, еще более важным являются свойства клеточной оболочки, определяющие форму клетки, ее отношение к соседним клеткам и среде и в конечном итоге свойства тканей и основные процессы морфогенеза [124-127]. Именно эти поверхностные свойства клеток определяют строго детерминированную геометрию эритроцитов и сложную форму нервной клетки. Строение клеток и всей ткани, в которую они входят и которую составляют, можно описать, если ограничиться всего тремя видами отношений клеточной поверхности: взаимоотношениями с такими же соседними клетками, взаимоотношениями с клетками других типов дифференцировки и, наконец, отношениями с окружающей их средой [128]. Так, например, морфологические свойства однослойного эпителия могут быть достаточно полно описаны как результат сцепления соседних эпителиальных клеток и отношения к наружной и внутренней средам. Так, "стремление" увеличить поверхность контакта между соседними клетками приводит к образованию столбчатого эпителия, а "стремление" уменьшить эту поверхность, наоборот, - к распластыванию. Нам приходится использовать антропоморфный термин "стремление", который ничем не хуже аналогичных по смыслу слов: "сродство" или "аффинитет", так как механизмы сцепления клеток и силы, определяющие свойства их поверхности, неизвестны. Однако очевидно, что они сводятся к простым физико-химическим свойствам поверхности.

Морфогенетические движения, ответственные за образование органов зародыша, также могут быть описаны как последовательные изменения поверхностных свойств клеток [129]. Как известно, образование спинного мозга у большинства позвоночных животных начинается с формирования нервной пластинки, которая отличается от окружающего эктодермального эпителия только большей высотой клеток, что определяется увеличением сродства между поверхностями соседних клеток и стремлением увеличить эту поверхность; это и осуществляется путем увеличения боковых стенок за счет уменьшения верхней и нижней поверхностей. Следующий этап дифференцировки - свертывание пластинки в нервную трубку - может быть описан как уменьшение внутренней и увеличение наружной поверхности клеток, обращенной к внешней среде. Стремление окружающего эпителия к распластыванию приводит к погружению нервной трубки и т. д. Подобные же изменяющиеся отношения объясняют и более сложные формообразования. Ранний зародыш амфибий на стадии поздней гаструлы схематически может быть представлен как совокупность трех концентрических слоев - эктодермы, мезодермы и энтодермы. Гольтфретером было показано [126], что их взаимное расположение - результат не только определенных морфогенетических перемещений в процессе гаструляции, но и сохраняющегося в клетках взаимного отношения их поверхностей друг к другу (Гольтфретер использовал термины "положительный и отрицательный аффинитет"). Выяснилось, что эктодерма и энтодерма имеют отрицательный аффинитет друг к другу, т. е. даже при насильственном соприкосновении их клетки стремятся отойти друг от друга. В то же время оба эти вида клеток, случайно вступая в контакт с клетками мезодермы, уже не отсоединяются от них (положительный аффинитет). Эктодерма отличается от энтодермы тем, что стремится обрасти снаружи те поверхности, с которыми находится в контакте. Все эти свойства приводят к тому, что если диссоциировать клетки поздней гаструлы и беспорядочно их перемешать, то в результате их взаимного отталкивания и сцепления поверхностей восстанавливается прежняя структура зародыша - энтодерма внутри, эктодерма снаружи, мезодерма между ними.

Механизм взаимоотношений клеточных поверхностей неизвестен [130, 131], но можно предполагать, что эти отношения напоминают комплементарное сцепление белков типа взаимоотношений антигена с антителом [132, 133]. В опытах Шпигеля было показано, что антисыворотки против эмбриональных клеток амфибий или клеток губок в первую очередь вызывают нарушение их поверхностных свойств, препятствуя сцеплению диссоциированных клеток [134].

Генетическая детерминация поверхностных особенностей может быть постулирована уже из тех общих соображений, что сами они определяются свойствами белков клеточной оболочки, которые синтезируются по информации, определяемой генами. Процесс морфологической дифференцировки и формообразования тканей и органов должен, следовательно, в значительной степени состоять в последовательной активации генов, определяющих синтез белков плазматической мембраны.

Подводя итог сказанному, мы можем заключить, что надмолекулярные внутриклеточные структуры играют ведущую роль во всех свойствах клеток, и в том числе в процессе их дифференцировки. Свойства этих структур в значительной степени определяются свойствами составляющих их молекул - белков, синтезируемых по генетическим матрицам, и небелковых соединений, синтез которых определяется белками. Прямая связь Внутриклеточных структур с генами и зависимость от них в ряде случаев совершенно очевидна (ядрышко, рибосомы, оболочки) и в некоторой степени характерна для всех структур клетки.

Однако в этой главе мы стремились обратить внимание на те (пока еще неполные и не всегда абсолютно убедительные) данные, которые показывали определенную автономность некоторых внутриклеточных образований (хлоропласты, митохондрии, гранулы одноклеточных) и роль надмолекулярной организации в передаче признаков от родителей к потомству, минуя основной путь информации через ДНК и белок.

6. Генетический контроль над процессами развития

В предыдущих разделах были рассмотрены начальные этапы действия генов. Теперь рассмотрим те относительно немногочисленные данные, которые показывают, как осуществляются последующие этапы реализации наследственных свойств - дифференцировка клеток и проявление активности генов в эмбриональном развитии.

1) Внешние условия клеточной дифференцировки

Определяющие дифференцировку внешние по отношению К клетке влияния, как правило, сами являются следствием генетической активности, но в то же время они активируют гены в тех клетках, на которые влияют, и вызывают в них появление новых свойств [135, 136]. Таким образом, эти механизмы развития являются механизмами взаимодействия генов в образовании фенотипа, которые описывались в первом разделе главы как явления плейотропизма и полигении.

В настоящее время с большей или меньшей определенностью можно говорить о трех механизмах, определяющих появление различий между клетками развивающегося организма: о ооплазматической сегрегации, градиентных отношениях и индукции. Ооплазматической сегрегацией называется появление различий между разными зонами оплодотворенного, но еще не делящегося яйца. В ряде опытов установлено, что именно начальная неоднородность цитоплазмы яйца и определяет первичные различия между клетками. В результате дробления зародыш состоит из клеток, содержащих одинаковые ядра, но различную цитоплазму, которая, оказывая на ядра специфические, различные в разных частях зародыша влияния, активирует в них различные гены, определяя таким образом разные пути их дифференцировки. Механизм ооплазматической сегрегации исследован очень неполно. Известно, однако, что определяющую роль в нем играет не распределение внутренних структур яйца, а организация поверхностного слоя. Так, например, у амфибий после оплодотворения в яйце можно различить три зоны: верхнюю, анимальную, из которой образуется эктодерма, нижнюю, вегетативную, образующую энтодерму, и промежуточную - зону "серого серпа", в области которой начинается гаструляция и которая дает начало мезодерме зародыша. Пересадка поверхностного слоя толщиной в 20-30 мк из области "серого серпа" в другую часть яйца приводят к гаструляции и затем образованию мезодермы в этом новом районе.

Участки цитоплазмы яйца, образующие различные зоны, не являются строго гомогенными, вдоль их поверхности могут наблюдаться некоторые количественные, "градиентные" отличия, которые в последующем приводят к качественно отличным путям развития. Примером таких взаимоотношений служат градиентные отличия от анимального к вегетативному полюсу яйца у морского ежа. Если изолировать бластомеры из разных уровней яйца, из них дифференцируются зародыши с преобладанием тех органов, которые характерны для соответственно анимальной или вегетативной зоны яйца. Комбинируя клетки из разных областей, можно получить как уродливый, так и вполне пропорциональный маленький зародыш, в зависимости от того, какое количество материала и из каких зон взято. Подобного рода градиентные отношения обнаруживаются и на более поздних этапах дифференцировки.

Наиболее изученным механизмом дифференцировки является индукция, т. е. влияние одной ткани на другую, изменяющее путь ее развития. Так, в ходе гаструляции у позвоночных зачаток хорды приходит в контакт с определенным районом эктодермы, и в результате этого контакта клетки данного района дифференцируются не в эпителий кожи, как вся остальная эктодерма, а образуют нервную систему животного. Механизм индукции состоит в образовании в клетках "индуктора" специфических веществ, которые мигрируют в соседнюю, индуцируемую ткань, изменяя путь ее развития. Как правило, природа этих индуцирующих веществ остается до сих пор неразгаданной. Для индуктора нервной системы характерна его невысокая специфичность: вещества с индуцирующим действием были выделены различными путями из самых разных тканей взрослых организмов. Однако существенно, что в зародыше эти вещества образуются и выделяются строго определенными клетками и для тех клеток, на которые они влияют, оказываются строго специфичными. Совершенно очевидно, что информация о дифференцировке нервных клеток не может содержаться в индуцирующих веществах - они лишь активируют те участки хромосом, которые определяют развитие именно нервных клеток. Роль индукции, таким образом, заключается в том, что ею определяется локализация и, отчасти, время дифференцировки, но не ее конкретный характер. В одном случае вещество индуктора было исследовано с большей тщательностью. Оно было выделено из эмбриональных нервных трубок зародыша цыпленка. Нервная трубка зародыша способна индуцировать в окружающей ее мезенхимной ткани образование хряща, которое, в частности, сводится к синтезу сложных серусодержащих полисахаридов, связанных с белками. Оказалось, что информация о таком сложном синтезе поступает из клетки нервной трубки в клетку мезенхимы в виде низкомолекулярного вещества - индуктора. Этот индуктор был выделен в чистом виде, он содержит аминокислотные группы и нуклеотиды и, по-видимому, является нуклеопептидом. Совершенно очевидно, что содержащаяся в нем информация может быть достаточной лишь для активации того или иного гена, но не для определения структуры высокомолекулярных соединений, характеризующих хрящевую ткань.

Три рассмотренных механизма дифференцировки - ооплазматическая сегрегация, градиенты и индукция не исчерпывают всех способов дифференциации, но нужно отметить, что все они в конечном итоге сводятся к активации генетического аппарата клеток. Как бы ни был сложен внешний механизм, вызывающий дифференцировку клетки, он всегда несет намного меньше информации, чем та, которая поступает из ядра после активации генов [135]. Поток информации из среды или из цитоплазмы в ядро определяет только выбор тех или иных генов, т. е. одну из десятков или сотен тысяч возможностей, в то время как обратный поток информации (из ядра в цитоплазму) несет информацию о последовательности аминокислот в белке, т. е. определяет выбор одной из астрономического числа возможностей. Если эти величины выразить в единицах информации (битах), то информация, определяющая активацию одного определенного гена (при их общем числе порядка 10⁵), имеет приблизительно 17 бит, в то время как информация о синтезе одного белка содержит не менее 10³-10⁴ бит, т. е. на два-три порядка больше^*. Отсюда очевидно, что при всей сложности ядерно-цитоплазматических взаимоотношений в развитии общий поток информации направлен из ядра в цитоплазму; этого и следовало ожидать.

^* (При таком приблизительном, как в данном случае, подсчете количества информации, когда вероятности каждого из многих событий можно считать равными, число единиц информации может быть определено как двоичный логарифм от числа возможных вариантов. Каждое сообщение - это выбор одной из многих возможностей и ценность его (количество информации) тем больше, чем больше число возможностей, среди которых производится выбор. В этом случае выбор данного, а не другого гена, из всех имеющихся в ядре, несёт значительно меньше информации, чем информация о построении данного белка из общего числа всех возможных сочетаний и последовательностей аминокислот.)

2) Начало действия генов

Как уже говорилось в предыдущем разделе, самые ранние стадии развития зародыша контролируются не его собственным генетическим аппаратом, а генотипом материнского организма, определяющим организацию яйца. На какой стадии развития включается собственный генетический аппарат эмбриональных клеток? Этот важный вопрос привлек многих исследователей, и было предложено несколько методов его изучения.

Цитологический метод позволяет судить об активности ядер по морфологическим показателям, и прежде всего по появлению ядрышек, поскольку они связаны с синтезом РНК в ядрах. У амфибий, рыб, иглокожих было обнаружено, что ядрышки появляются только после завершения основных делений дробления на стадии бластулы [137]. У моллюсков они появляются раньше - на стадии 8-16 клеток [138], а у млекопитающих еще раньше, уже на стадии двух бластомеров. Само их появление, однако, не является одномоментным событием и состоит в конденсации мелких ядрышек в крупные (у моллюсков) или в большей окрашиваемости их основными красителями (у рыб, амфибий). Поэтому данный метод не позволяет оценить начало генетической функции с большой точностью, тем более что сама связь "начала активности генов со строением ядрышек не является очевидной. Более того, последние данные показывают, что ядрышки ответственны только за синтез рибосомной РНК, в то время как у многих зародышей этот синтез начинается относительно поздно. Безъядрышковые зародыши амфибий способны развиваться до относительно поздних стадий.

Несомненным проявлением функции генотипа является морфологическое и функциональное выражение различных мутаций, в первую очередь летальных. Однако почти ни в одном случае мы не можем быть уверены, что данная мутация - самое раннее проявление ядерной функции. Примером таких ранних мутаций может быть уже упоминаемая мутация t¹² из серии Т у мышей. Она вызывает остановку развития наиболее рано, уже на стадии четырех суток, когда зародыш представляет собой недифференцированный зародышевый узелок, окруженный трофобластом [139]. У дрозофилы отсутствие половой хромосомы приводит к остановке развития после нескольких делений ядер, еще до образования бластодермы [140]. Интересным, хотя еще не объясненным, фактом является проявление мутации deep orange (dor) у дрозофилы на сверхранней стадии развития [141]. Эта мутация вызывает глубокие нарушения в строении яйца и даже в гетерозиготном состоянии приводит ко многим нарушениям развития, а в гомозиготном она, безусловно, детальна. Оказывается, что при оплодотворении яйца от самки с мутацией dor спермиями самца dor нарушения наступают сразу и проявляются в виде неправильных фигур кариокинеза еще при втором делении созревания. Нам кажется, однако, неверным заключение Хадорна [5] о том, что мы имеем дело с ранней функцией генов на стадии оплодотворения, так как представить генетическую функцию в спермин, только что вошедшим в яйцо и еще не образовавшем пронуклеуса, невозможно.

Объяснение этого случая следует, видимо, искать в патологическом строении самого спермия. Мутация dor вообще принадлежит к тем, которые действуют еще до начала эмбрионального развития, при образовании гамет, и можно себе представить, что такие же нарушения, которые обнаруживаются в яйце dor, могут быть в опермии, что и приводит к такому раннему проявлению его функции, т. е. нарушению механизма активации яйца.

Ценные данные были получены при изучении летальных гибридных комбинаций, особенно у амфибий и иглокожих [142, 143]. При скрещивании многих видов развитие зародышей останавливается на стадии поздней бластулы, и ни при какой гибридной комбинации остановка развития не происходит раньше (если не считать, конечно, такие комбинации, при которых не происходит самого оплодотворения). Таким образом, несовместимость ядер и цитоплазмы впервые проявляется у амфибий на стадии поздней бластулы.

К тому же выводу приводят и результаты опытов по созданию безъядерных зародышей. У морских ежей они создаются отделением ядра при центрифугировании [144], а у амфибий удалением женского ядра иглой и инактивацией спермиев высокой дозой радиации [145]. Безъядерные зародыши амфибий доходят в своем развитии до поздней бластулы, а у морского ежа - до средней.

Недостатком всех перечисленных методов является то, что они не позволяют обнаружить стадию начала собственно генетической активности, а только устанавливают ее проявление в виде нарушений или остановки развития. Однако между началом генетического контроля и таким сложным процессом, как морфогенез, должно пройти некоторое, может быть значительное, время. Определение начала собственно генетической функции ядер было произведено путем инактивации морфогенетической функции ядер действием высоких доз ионизирующей радиации на разных стадиях развития [146]. Было показано, что у рыб и амфибий инактивация ядер, вплоть до средней бластулы, приводит к остановке развития на одной и той же стадии - поздней бластуле. Следовательно, вплоть до средней бластулы ядра не осуществляют генетического контроля над развитием. После средней бластулы последовательная инактивация ядер на все более поздних стадиях приводит к более поздней остановке развития, причем инактивация более поздняя на один час приводит к остановке развития на 3-4 часа позже. Это означает, что, начиная со средней бластулы, осуществляется активная морфогенетическая функция ядер. Аналогичные данные были получены и на других объектах, при этом для разных видов характерны свои стадии начала морфогенетической функции [147]. Особенно рано морфогенетическая функция начинается у животных с мозаичным типом развития: у моллюсков, например, на стадии 12-16 бластомеров, а у аскариды еще раньше, уже на стадии 2-4 бластомеров.

Радиационная инактивация является не единственным методом блокирования ядерной функции, и аналогичный результат может быть получен и при химической инактивации ядер такими специфическими веществами, как актиномицин Д или митомицин С.

Так, на зародышах морского ежа, проницаемых для этих веществ, было показано методами и радиационной, и химической инактивации, что морфогенетическая функция ядер начинается на стадии ранней бластулы [148].

Периоды морфогенетической активности ядер не могут быть отождествлены с активностью ядер вообще и, как показал Спирин [149], даже с синтезом РНК. Хотя с началом морфогенетической активности интенсивность синтеза РНК в ядрах резко повышается [150], сам период активности следует, по-видимому, рассматривать как период, в течение которого синтезируются РНК или другие вещества, определяющие именно процессы морфогенеза.

3) Летальные факторы в развитии

Стадии проявления мутаций

Наиболее простой и прямой метод обнаружения генного контроля в развитии - исследование механизма действия летальных мутаций. Первой характеристикой этих мутаций является их связь со стадией развития, иллюстрирующей распределение генетической активности во времени. Можно различать монофазные летальные факторы, которые приводят к смерти организмов на одной определенной стадии, ди- и полифазные факторы и, наконец, факторы, которые действуют афазно, т. е. не связаны с какой-либо одной стадией [5].

Примером мутации, строго связанной со стадией развития, может служить уже упомянутая серия мутаций Т у мышей и мутация yellow, которая в гомозиготных комбинациях приводит зародышей мыши к гибели на пятые сутки развития [151]. Характерно, что первые четверо суток развития проходят совершенно нормально, но затем вместо имплантации быстро наступает остановка развития и начинается дегенерация зародышей. У дрозофилы целая группа мутаций приводит к гибели организма точно на стадии третьего личиночного возраста [5]. Однако стадия, на которой происходит смерть организма, еще не означает, что мутантный ген начинает функционировать на этой стадии или незадолго перед ней. Установить действительную стадию начала функции, как правило, очень трудно или невозможно. Сам момент гибели, хотя может и должен рассматриваться как определенный "признак", контролируемый мутанным геном, связан, скорее, не со стадией активности гена, а с характером тех нарушений, которые вызывает мутация, и отношением организма к окружающим условиям. Хорошей иллюстрацией этого положения являются мутации растений, блокирующие синтез хлорофилла. Эти мутантные растения, независимо от того, в каком звене блокируется синтез, погибают тогда, когда исчерпываются запасы питания, содержащиеся в эндосперме, и возникает необходимость в фотосинтезе [152]. Таков же механизм и многих других моно- и дифазных леталей. В этом смысле интересны данные, собранные Хадорном и Ченом для 59 мутаций второй хромосомы дрозофилы [153]. Оказалось, что для 14 мутаций характерна гибель на эмбриональных стадиях, причем в 6 случаях из них она наступает при вылуплении из яйца, 6 видов мутантов погибают в первом личиночном возрасте, 15- в третьем и 5- на стадии куколки; 13 мутаций оказываются полифазными, при этом гибель 5 из них начинается еще в эмбоиональном развитии, хотя некоторые доживают до куколки. Остальные мутации начинают проявляться позже, уже в личиночном возрасте. Распределение сроков гибели различно для леталей, полученных разными путями. Мутации, вызванные ионизирующим излучением, чаще приводят к эмбриональной гибели, чем спонтанные мутации или мутации, вызванные химическими мутагенами [154]. Это явление легко объяснить, если учесть, что облучение часто вызывает значительные хромосомные нехватки, в то время как химические факторы и спонтанные мутации обычно касаются отдельных генов. Естественно, что поражение целой группы локусов с большей вероятностью затронет ген, функционирующий в раннем развитии, чем при изменении одиночных генов. Это хорошо иллюстрируется исследованием различных хромосомных нехваток половой хромосомы дрозофилы, затрагивающей ген Notch [140]. В отсутствие всей хромосомы (приблизительно 1000 лент полигенной хромосомы) гибель, как уже говорилось, наступает после нескольких делений ядер, через час после оплодотворения. Если же нехватка затрагивает меньший, но все еще очень значительный участок, включающий 50 лент, и в том числе ген Notch, гибель наступает через 6 час. после начала эмбрионального развития. Все другие меньшие нехватки, включающие локус Notch, приводят к тому же результату, и, наконец, мутация (выключение) только одного гена Notch тоже приводит к остановке развития и смерти на шестом часу развития. Это означает, что ни один из генов, расположенных в большом отрезке хромосомы (50 лент), не является необходимым для прохождения ранних стадий развития и раньше всех из них начинает функционировать Notch.

Рассматривая большой суммарный материал по летальным мутациям у дрозофилы, можно видеть, что большинство мутаций группируется друг с другом и вызывает гибель на определенных критических стадиях - в начале личиночного развития, при окукливании, при выходе имаго. Аналогичным образом у млекопитающих такими критическими стадиями являются имплантация зародышей и рождение. Эти критические периоды похожи друг на друга в том отношении, что для организма они означают переход к иному образу жизни, т. е. изменению отношений с внешней средой. Нарушения, которые начались на ранних стадиях, могут не являться летальными на этих стадиях, поскольку затрагивают только те органы, которые необходимы для будущих этапов жизни. Так, например, все нарушения аппаратов дыхания и питания у зародышей млекопитающих не будут летальными в эмбриональном развитии (хотя морфологически могут проявляться очень рано), но приведут к быстрой гибели сразу после рождения. У зародыша цыпленка мутация creeper вызывает различные нарушения, связанные с неправильным развитием мезенхимных производных, но характер летальности у них двухфазный и приходится на 3-й и 20-й дни инкубации [155, 156]. Он связан с нарушением аппарата кровообращения и проявляется в начале развития, когда диффузное питание и газообмен уже не могут обеспечить развитие зародыша. На 20-й день начинается дыхание зародыша его собственными легкими, теперь к смерти приводят все ранее возникшие нарушения, затрагивающие сам аппарат дыхания и связанные с ним системы.

Примеры действительно афазных факторов, вызывающих равномерную гибель на всем протяжении развития, неизвестны. Но к ним можно отнести такие нарушения, которые резко уменьшают адаптационные способности организма, и тогда любое изменение внешних условий может оказаться причиной гибели на любой стадии. Таким фактором можно считать, например, гемофилию, когда гибель происходит после любого нарушения целостности сосудов, в любой момент жизни.

Место проявления мутаций

Если первой важной характеристикой наследственных нарушений развития является их распределение во времени, то второй такой характеристикой является локализация этих нарушений, т. е. вопрос о том, затрагивает ли мутация клетки всех органов или только определенные части зародыша и какие именно. И если первая характеристика имеет большое значение для понимания порядка активации генов по мере развития, то вторая позволяет подойти к механизму дифференциальной активности генов в разных эмбриональных зачатках.

При рассмотрении вопроса о локализации летальных мутаций следует различать и раздельно рассматривать две близко связанные, но самостоятельные проблемы - о дифференциальной активности генов в разных частях зародыша и о степени автономности развивающихся зачатков. Для решения этих проблем необходимо ответить на два различных вопроса: 1) проявляются ли эти мутации во всех клетках организма, в клетках одного вида ткани или только в клетках одного органа; 2) является ли наследственное нарушение развития того или иного органа следствием поражения его собственных клеток, поражения других частей организма, или обе эти причины могут сочетаться? Рассмотрение широкого круга летальных мутаций позволяет получить определенный ответ на все эти вопросы и найти примеры, иллюстрирующие каждую из перечисленных возможностей. При этом следует учитывать, что, оперируя с данным материалом, мы рассматриваем не только сравнительно узкую проблему реализации летальных мутаций, но и конечные звенья механизма проявления генетических факторов в развитии.

Очень трудно доказать, что данная мутация затрагивает все клетки организма. Но если мы убеждаемся, что тот или иной генетический эффект является достаточно плейотропным (т. е. обнаруживает свое действие в различных тканях и органах) и вместе с тем является автономным (т. е. проявляется в разных клетках независимо друг от друга), то можно считать, что данная мутация реализуется во всех или в большинстве клеток организма. О таком генерализованном проявлении генетического действия следует говорить также и в том случае, если будут обнаружены биохимические нарушения общего характера, не связанные со специфической функцией отдельных органов. Примером первого типа могут служить мутации t¹² [139] и yellow [151] у мышей, которые выражаются в ранней дегенерации еще не дифференцированного бластоциста. Гарантией того, что мутация затрагивает все клетки, является сам факт недифференцированности клеток на этих ранних стадиях, а, следовательно, их сходства. Одновременная дегенерация всех клеток указывает на повсеместность эффекта. Данный пример не является очень показательным, поскольку речь идет о такой стадии, когда весь организм может рассматриваться как одна ткань, или один "орган", и эти примеры могут в такой же степени иллюстрировать возможность генерализованного действия генов, как и его ограниченность одним видом клеток.

Может быть, более убедительным примером следует считать мутацию дрозофилы, описанную как "летальная полиплоидия" [157]. Она затрагивает все имагинальные диски личинок и выражается в нарушении механизма клеточных делений. В быстро делящихся клетках имагинальных дисков подавляется расхождение хромосом, в то время как их дупликация продолжается, что приводит к образованию клеток, содержащих сотни хромосом у этого вида дрозофилы, вместо нормальных двенадцати. Развитие всех зачатков задерживается и нарушается, в конечном итоге личинки погибают.

Третьим примером общей реакции может, по-видимому, служить высокоплейотропная мутация lozenge-clawless (lz^Cl), которая, как уже указывалось, затрагивает десятки органов и признаков дрозофилы. Пересадки имагинальных дисков показали, что все эти нарушения являются автономными. Это позволяет заключить, что мутация проявляется во всех или во многих клетках, вне зависимости от их тканевой принадлежности [6]. Однако нарушения, которые она вызывает, обнаруживаются, естественно, не во всех без исключения частях и проявляются в разных органах тоже различно. Механизм этой мутации не известен, но нарушение какой-либо органонеспецифичной, но важной биохимической реакции может привести к подобному результату, также как авитаминоз приводит к различным нарушениям в самых разных органах и тканях.

У яиц дрозофилы, лишенных Х-хромосомы (мутация nullo-X), полностью подавляется рост интенсивности дыхания, происходящий в развивающемся яйце [158]. Полное отсутствие прироста показывает, что и в этом случае затронуты все клетки, а не какая-либо часть их. Правда, при этой серьезной генетической нехватке развитие останавливается очень рано, когда дифференциация еще не наступила.

Бидл и Эфрусси путем пересадки имагинальных дисков между линиями дрозофил с разными мутациями цвета глаз показали, что большинство локусов, ответственных за образование глазного пигмента, функционируют автономно, т. е. только в зачатках глаза [159]. Но две мутации vermillion и cinnabar, вызывающие киноварный цвет глаз, не автономны и выражаются в изменении внутренней среды личинки, влияющей на развитие глазного пигмента. Оказалось, что эти мутации блокируют начальные этапы синтеза пигмента, а именно превращение триптофана в кинуренин (vermillion) и кинуренина в оксикинуренин (cinnabar) [160]. Можно предполагать, что эти достаточно общие реакции осуществляются не в каком-либо одном органе, а происходят во всех тканях, а следовательно, во всех тканях функционируют и локусы v⁺ и cn⁺. Аналогичная неавтономная локализация свойственна и другой мутации цвета глаз - rosy [161]. Этот локус ответствен за синтез фермента - ксантиндегидрогеназы, которая необходима для синтеза одного из предшественников красного пигмента глаз дрозофилы - изоксантоптерина [162, 163].

Рассматривая мутации, затрагивающие отдельные ткани, мы сталкиваемся с той трудностью, что объединение клеток разных органов в одну ткань (например, эпителиальную) всегда несколько субъективно и может не отражать истинной общности или различий. Но очевидно, что все клетки красного кровяного ряда являются одной тканью. Поэтому все мутации, затрагивающие гемоглобин, являются, безусловно, специфичными для этой категории клеток. Однако, выделяя мутации, характерные именно для ткани, а не для органа, мы имели в виду показать общность некоторых генетических функций, которые объединяют сходные клетки из разных органов. В этом смысле ретикулоциты не являются показательным примером. Более интересна мутация крыс - хондродистрофия, затрагивающая, как показывает название, образование хряща [164]. Недоразвитие хрящевых клеток в той или иной степени затрагивает все органы, но полной равноценности в этом процессе нет и наиболее сильные нарушения обнаруживаются в развитии хрящевого скелета ребер и грудины. Последствием этих нарушений является целый ряд вторичных уродств, приводящих гомозиготных мутантов к гибели. Эта мутация хорошо иллюстрирует именно тканевое проявление и относительную независимость от того, в каком органе эта ткань дифференцируется. Однако даже в отношении развития того же скелета это далеко не всегда так.

Мутации, затрагивающие только определенные клетки определенных органов, наиболее часты, и мы можем привести здесь лишь небольшую часть известных случаев. Продолжая рассматривать нарушения скелета, интересно остановиться на двух мутациях, встречающихся у телят [165]: одна под названием "короткий хребет" делает животных похожими на оленя, а вторая - "ампутированные" - приводит к резкому укорочению конечностей, которые выглядят как отрезанные. В обоих случаях эти нарушения не единственные, но затрагивают они только скелет. Однако в отношении того, какая часть скелета поражается, обе мутации как бы дополняют друг друга. У телят, мутантных по гену "короткий хребет", уродливыми являются ребра, грудина и позвоночный столб, а череп, челюстные кости, таз и конечности развиваются совершенно нормально. У мутантов же "ампутированные" все происходит наоборот: позвоночный столб, ребра и грудина у них нормальны, а поражение затрагивает череп, челюстные кости, плечевой и тазовый пояс и, особенно сильно, конечности. Возможна и еще большая специфичность эффекта. У свиней с мутацией "обтекаемые" [166] все части тела развиваются нормально, кроме обеих пар ног, которые полностью отсутствуют. Следует упомянуть, что еще Дарвин описал несколько поколений свиней, рождавшихся только без задних ног. Из сопоставления всех фактов становится очевидно, что есть гены, которые функционируют во всех скелетогенных клетках, в клетках некоторых частей скелета и, наконец, только в клетках данного типа кости или хряща.

Можно привести примеры еще более строгой локализации генетического эффекта. Так, мутация мышей dwarf - карликовый рост - затрагивает только эозинофильные клетки передней доли гипофиза [167-169]. Вследствие этого у мышей не образуются гормон роста и гонадотропные гормоны, продуцируемые гипофизом, в результате чего нарушается рост и недоразвиваются гонады.

При мутации "безпалочковая сетчатка" у домашних мышей глаза внешне нормальны, но мыши слепы. Это связано с тем, что, хотя в глазу нормально развиты все оболочки и присутствует сетчатка, в ней дифференцированы ганглиозный слой и внутренний ядерный слой, но наружный ядерный слой и слой палочек полностью отсутствуют [170].

Цыплята с мутацией shaker вылупляются совершенно нормальными, но в четырехнедельном возрасте у них начинает трястись голова (shaker - трясун), а затем нарушается координация движений: они не могут стоять, есть и погибают от истощения. Причина этих нарушений состоит в специфической дегенерации клеток Пуркинье в мозжечке [171].

Таким образом, полученные данные хорошо согласуются и подтверждают представления о том, что дифференцировка связана и обусловлена функцией набора генов, специфического для каждого вида клеток; при этом одни гены активны во многих или даже во всех видах клеток, в то время как другие функционируют только у одного специфического вида клеток, может быть даже не очень многочисленных.

Вопрос о том, осуществляется ли процесс развития данного вида клеток только за счет активности генов, локализованных внутри этих же клеток, или за счет влияния других частей организма, разрешается, как правило, путем трансплантаций между мутантным и нормальным организмами. Надо, однако, иметь в виду, что и эти опыты не всегда могут дать однозначный результат, особенно если делается вывод о неавтономной зависимости. Примером, показывающим источник возможной ошибки, могут служить опыты с трансплантацией на нормальные растения проростков растений, несущих мутацию, подавляющую синтез хлорофилла. При росте в обычных условиях эти растения быстро погибают, но привитые на нормальные растения, они зеленеют в некоторой степени и, главное, образуют листья, цветы и даже семена [172, 173]. При поверхностном подходе можно было бы думать, что гибель надземных частей растения не автономна и вызывается мутационным поражением корней, так как прививка стебля на здоровое растение спасает мутант. Однако в действительности все обстоит наоборот: первично поражаются как раз зеленые части растения. Результат эксперимента вполне понятен - неспособные к фотосинтезу растения погибают, когда исчерпывается питание, содержащееся в семени, но при прививке на нормальное растение они получают это питание. Вместе с тем ясно, что мутация является автономной и в мутантных клетках хлорофилл не образуется, в каких бы условиях они ни находились. В данном случае этот вопрос легко решить благодаря тому, что причина гибели и механизм мутации очевидны и легко поддаются исследованию. В большинстве же случаев непосредственная причина гибели не известна, и решить вопрос об автономности не всегда бывает легко.

Примеров автономных летальных мутаций очень много. Так, зачатки хряща эмбрионов мыши с мутацией хондродистрофии проявляют автономность при пересадках в нормальное животное, обнаруживая такие же дегенерациовные изменения, как и в мутантном организме [164]. Если от кур с мутацией fizzle (закрученность перьев) пересадить кусочки кожи к нормальным животным, то цвет и патологическая форма перьев сохранятся и на месте пересадки [156].

Примеры зависимости развития особенно очевидны при наследственных поражениях эндокринной системы. Так, все сложные аномалии развития у мышей с мутацией dwarf обусловлены поражением передней доли гипофиза, но не прямым действием генов на другие органы. Таким же образом все мутации, затрагивающие систему кровоснабжения, - недоразвитие сердца, слабая васкуляризация, анемия - приводят к нарушениям в развитии глаза, так как дифференцировка сетчатки и пигментного слоя связана с их кровоснабжением. Возможны ситуации, когда при плейотропном эффекте единственного гена одни поражения связаны с автономным проявлением, а другие - с зависимым. При мутации creeper у цыплят пересадка зачатков конечностей нормальному зародышу или в культуру ткани приводит к таким же дистрофическим нарушениям скелета, как и в мутантном организме [174]. В то же время глаза, которые у мутанта creeper обнаруживают ряд патологических изменений, в нормальном организме развиваются без всяких нарушений [175]. Сложнее случай с пересадкой кожи от мышей с мутацией rhyno на спину нормальных мышей. Кожа этих мышей голая и имеет складки, делающие ее похожей на кожу носорога (Rhyno). При пересадке этим мышам нормальной кожи она развивается совершенно нормально, не обнаруживая влияния мутантного хозяина [176]. Иная картина наблюдается при пересадке кожи мутанта на спину нормальным животным. Центральная часть имплантата лишена волос и имеет такие же складки, как у мутантных животных, но на периферической части трансплантата вырастают нормальные волосы. Это показывает, что проявление мутации автономно, но из клеток кожи хозяина могут мигрировать вещества, отсутствующие в мутантных клетках и необходимые для роста волос. Мутантные клетки потеряли способность производить эти вещества, но сохранили способность их утилизировать и дифференцироваться в их присутствии.

В заключение мы рассмотрим случай, когда развитие признака, обусловленного одним геном, связано и с прямым автономным его действием, и с опосредованным влиянием среды, измененной тем же геном. Речь идет все о той же мутации мышей yellow. Гомозиготные животные с этой мутацией не существуют, так как погибают на ранних эмбриональных стадиях; их получение состоит в скрещивании самца и самки с генотипами +/А, т. е. гетерозиготных по этому гену. В 25% случаев зародыши будут иметь генотип A^y/A^y. Развитие этих зародышей происходит не в нормальной среде, так как нормальный аллель этого гена обладает только относительной доминантностью, и матери, гетерозиготные по этому признаку, обнаруживают некоторые отклонения от нормы. Чтобы избежать влияния этих отклонений, яичники от самок +/А^y пересаживались нормальным самкам +/+, которые скрещивались с самцами +/А^y [151]. В результате этого 25% зародышей имели генотип +/A^y, но развивались в нормальном материнском организме +/+ . При сравнении этих зародышей с контролем (тот же гомозиготный генотип, но среда +/А^y) были обнаружены четкие отличия. У зародышей в нормальном окружении наблюдается некоторая незначительная дифференцировка (в контроле ее нет совсем) и количество клеток к моменту гибели вдвое превышает количество клеток в зародышах контроля. Однако дегенерация клеток в обоих случаях наступает в одни и те же сроки. Таким образом, хотя основной эффект - ранняя дегенерация - связан с автономным действием генов, часть эффекта может быть вызвана и влиянием материнского организма, несущего тот же ген в гетерозиготном состоянии.

Таким образом, упрощенно или просто неверно сводить всю дифференцировку клетки к определенной последовательности функции генов. Значительную, хотя и не ведущую роль играет также взаимодействие генов, осуществляемое между клетками в виде миграции определенных веществ, контролируемых ими., Примером таких влияний являются индукционные взаимодействия соседних тканей и гормональная система регуляции.

Данные, приведенные в этом разделе, являются прямым доказательством положения, неоднократно упоминаемого и раньше, о том, что функция генов в развитии меняется во времени и в различных клетках зародыша. Уже самые начальные этапы морфогенетической функции ядер обнаруживают закономерное распределение активности во времени, специфичное для каждого вида. В дальнейшем развитии - эмбриональном и постэмбриональном - для каждого гена характерно свое распределение активности.

Общая программа генетической функции является двумерной, так как в клетках разных органов и тканей план генетической активности различен. Есть гены, функционирующие во всех клетках и практически в течение всей жизни организма (например, гены, определяющие синтез дыхательных ферментов), и гены, функционирующие только и одном виде клеток и в течение только одного короткого отрезка развития (гены, ответственные за последние этапы дифференцировки специализированных клеток, например клеток Пуркинье). Между этими крайними вариантами возможны все мыслимые виды распределения, и полное понимание генетического контроля над становлением признаков требует знания этого пространственного распределения.

7. Генетический контроль над сложными признаками

1) Взаимодействие генов в развитии

В начале этой главы мы говорили о том, что понятие "признак" может рассматриваться на разных уровнях - от синтеза белковых молекул до сложных морфологических и функциональных черт и особенностей организма. Чем сложнее признак, тем труднее исследование его генетической обусловленности. Трудности связаны прежде всего с тем, что в формирование сложных признаков включаются многие гены и анализ их роли не может быть произведен обычными гибридологическими методами, а характер расщепления не описывается такими простыми зависимостями, как 3:1, 15:1 и т. д. Подобное последовательное включение и взаимодействие генов можно увидеть, рассмотрев ранние стадии эмбрионального развития, например, у амфибий.

Первая группа генов включается еще в оогенезе, при росте и созревании ооцита. У амфибий эта активность выражается в образовании в гигантском ядре (зародышевом пузырьке) "ламповых щеток", когда сотни генов вдоль каждой хромосомы образуют петли, выступающие поперек оси хромосом [177]. Каждая из них представляет активность одного гена или небольшой группы генов. Характерно, что такая сложная и специфичная дифференцировка хромосом, как "ламповые щетки", оказывается обратимой и в ходе овуляции из них опять образуются обычные хромосомы, содержащие полную генетическую информацию. Хотя в оогенезе одновременно функционирует очень большое число генов, их количество во много раз меньше общего числа генов и охватывает только некоторые хромосомные локусы, в то время как промежутки между ними на этой самой ранней стадии онтогенеза оказываются нефункционирующими. Несмотря на всю важность ранних процессов развития, количество генов, их определяющих, по-видимому, не превышает 1-3% от общего числа, а, может быть, составляет только доли процента. В результате деятельности этих генов формируется цитоплазматическая структура яйца и обеспечивается ооплазматическая сегрегация. У амфибий она, как уже указывалось, состоит в образовании трех первичных цитоплазматических зон, соответствующих дифференцировке эктодермы, мезодермы и энтодермы. Однако ооплазматическая сегрегация определяет не все свойства зародышевых листков, а только их пространственную локализацию и, что не менее важно, те свойства, которые в начале гаструляции активируют гены, специфично функционирующие только в эктодерме, мезодерме или энтодерме. Проявление функций этих генов начинается до начала гаструляции, но уже после того как ядра распространяются по всему яйцу и окажутся в соответствующем цитоплазматическом окружении. Таким образом, первый этап дифференцировки в зародыше (образование зародышевых листков и реализация их свойств в виде морфогенетических перемещений в ходе гаструляции) требует участия и взаимодействия двух групп генов - тех, которые были активны в оогенезе, обеспечили сегрегацию и предопределили формирование всех трех листков, и тех которые были активированы перед гаструляцией в каждом листке отдельно продуктами ооплазматической сегрегации и набор которых специфичен для каждого зародышевого листка.

Процесс взаимодействия генов продолжается и в дальнейшем развитии. Эктодермальные клетки, которые оказываются на спинной стороне зародыша над зачатком хордомезодермы, дифференцируются в нервные клетки. Это происходит вследствие того, что активные гены в клетках зачатка хорды обеспечивают образование индуцирующих веществ, которые мигрируют в прилегающую к ним эктодерму и активируют в ней гены, специфически активные только в зачатке нервной системы. Таким образом, за процесс дифференцировки становятся ответственными еще две группы генов - хорды и нервной трубки. В процессе дальнейшего развития активируются все новые гены, и в итоге свойства нервной клетки контролируются многими десятками, сотнями, а возможно и тысячами генов, функционирующими на последовательных стадиях развития и прямо или косвенно обеспечивающими дифференцировку нервных клеток. Аналогичным образом, но с участием иного набора генов, дифференцируются и все другие клетки.

Если рассматривать проблему развития в формальном, чисто генетическом аспекте, искусственно отвлекаясь от механизмов опосредования генетического действия, то все развитие можно свести к взаимодействию генов между собой, причем пространственный и временной характер их взаимодействия и выбор связей между ними определяется самим же генотипом. Все соматические элементы клеток зародыша служат только механизмом для реализации этого межгенного взаимодействия.

2) Участие внешних условий в формировании сложных признаков

В процессе эмбрионального развития генотип зародыша является почти единственным источником информации, к которой добавляется лишь некоторая информация, привносимая материнским организмом. Участие внешней среды, как источника информации для развития, в этот период невелико, поскольку зародыш приспособлен к тем условиям, в которых он развивается, и информация о них тем самым уже включена в его генотип. Колебания условий внешней среды не могут нести полезной информации, так как сами эти колебания незакономерны и обычно мало связаны с теми условиями, в которых окажется организм в постэмбриональный период; изменение хода развития (использование информации) под влиянием подобных колебаний, как правило, не может иметь адаптивного значения, и в эволюции были выработаны приспособления (оболочки, запасы питания, регуляция), защищающие зародыш от случайных колебаний (если они не выходят за пределы физиологического оптимума, к которому организм приспособлен). Можно, однако, ожидать, что в некоторых случаях такие факторы, как температура, соленость воды, некоторые гормоны материнского организма у млекопитающих, могут служить "сигналом" об условиях будущего и вызывать адаптивные подготовительные изменения к этим условиям. Так, температура может быть сигналом о времени года и может приводить к развитию сезонных рас у некоторых низших ракообразных. Степень солености воды может служить сигналом для образования модификаций в строении хвоста у рачка Artemia salina.

В случае наступления повторной беременности у кормящей крысы изменение гормонального фона в связи с кормлением является сигналом для наступления диапаузы в развитии зародышей.

Как уже указывалось выше, количество информации, которое может поступить в зародыш извне, очень невелико и при попытке оценить его в битах оказывается по меньшей мере на три порядка (а вероятнее, на четыре-пять) меньше количества генетической информации [178].

Однако в постэмбриональный период развития, при формировании многих сложных признаков, в частности признаков, связанных с ростом, размножением и поведением, роль внешней среды, как источника информации, чрезвычайно возрастает и оценить роль наследственного и внешнего компонентов оказывается очень трудно.

Многие хозяйственно-важные признаки домашних животных могут лишь частично определяться наследственными свойствами, а практически они целиком зависят от условий кормления и содержания. В то же время другие признаки более-автономны от внешней среды, хотя и могут быть ими сильно модифицированы. Так, например, яйценоскость кур в большой степени зависит от условий кормления, освещения и т. д., в то время как размер яиц является более стабильным признаком, характеризующим породу. Надо, однако, подчеркнуть oтносительность этих понятий - при благоприятных условиях различия в любых признаках будут целиком зависеть от генетических свойств, в то время как недостаток какого-либо внешнего компонента может целиком лимитировать проявление признака, практически независимо от наследственных особенностей.

Очень сложны взаимоотношения генотипа и внешних условий при формировании такого сложного признака, как поведение. Простые и сложные реакции поведения и их комплексы (пугливость, агрессивность, обучаемость и т. д.), безусловно, зависят и в значительной степени предопределяются наследственными свойствами, но в то же время условия воспитания могут значительно модифицировать наследственные особенности поведения и даже совсем их замаскировать [179]. Более тщательный экспериментальный анализ позволяет выделить наследуемое и приобретенное даже в таких, казалось бы первичных и элементарных инстинктах, как отношение к матери. Так, для диких гусят "матерью" становится любой подвижный предмет, который они видят в первые часы после вылупления из яйца. В эксперименте ею может стать человек или даже неодушевленный предмет. Раз созданные представления о "матери" сохраняются у животных все последующее время. Таким образом, у гусят наследуемым является стремление и способность увидеть и запомнить подвижный предмет, а также следовать за ним и подражать ему. Сам внешний вид предмета (в норме им, естественно, является гусыня) определяется в первые часы постэмбриональной жизни. Аналогичным образом у новорожденных обезьянок "сигналом" о материнском организме является поверхность, покрытая шерстью.

Роль информации, поступающей извне, оказывается еще большей при рассмотрении умственной деятельности человека. Наследственные особенности в этом случае (если исключить наследственные психические заболевания) выявляются с большим трудом (метод близнецов), и роль условий развития и воспитания приобретает решающее значение. Эта тенденция, увеличивающая роль внешней среды в формировании поведения, является эволюционно обусловленной.

Процесс эволюции центральной нервной системы в прогрессирующих стволах эволюционного древа шел по линии уменьшения заранее заданной информации и увеличения способности приобретать эту информацию в течение жизни. Соответственно, и в связи с этим, возрастала способность активно приспосабливаться к разнообразным и неожиданным комбинациям внешних условий, которая отличает высших млекопитающих и человека от остальных животных.

8. Заключение

Проблема гена и признака, если рассматривать ее в общем виде, представляет собой существенную часть ряда наук: генетики, эмбриологии, биохимии и др. Не все части этой проблемы разработаны в равной степени, и не все они представлены в этом обзоре с равной полнотой. Основной целью настоящей статьи было показать последовательный путь развертывания генетической информации от хромосом, в которых она хранится и с которыми передается потомкам, до признаков взрослого организма. Проблема гена и признака была бы крайне обеднена, если представить ее в чисто генетическом плане, когда рассматриваются только начальные условия - генотип и его соответствие конечным результатам - фенотипу. Многократное перекодирование и переработка генетической информации, взаимодействие ее элементов на всех этапах развертывания, являются отличительными чертами этого процесса, если рассматривать его с позиций теории информации. На уровне молекулярной биологии и биохимии реализация наследственности в виде признаков представляется как регулируемый нестационарный процесс, складывающийся из колинеарного синтеза макромолекул и ферментативного синтеза других химических соединений в клетке. Для эмбриолога и цитолога путь от гена до признака может рассматриваться как последовательное усложнение внутриклеточной организации (дифференцировки) и морфогенеза органов и тканей. Свои подходы к проблеме найдут физиолог, иммунолог и даже психолог. Мы попытались осветить эту проблему с разных сторон и представить ее как одно целое.

Литература