Новости     Библиотека     Словарь-справочник     Ссылки     О сайте













предыдущая главасодержаниеследующая глава

7.1. Мониторинг "распознающей" функции Т-лимфоцитов

Вся линия иммунологического мониторинга в клинической иммуногенетике началась с характеристики "распознающей" функции лимфоцитов с помощью методов, пришедших из классической иммунологии, но которые, как оказалось, отражают определенный уровень регуляции активности Т-лимфоцитов со стороны большого комплекса гистосовместимости человека.

7.1.1. Бласттрансформация под действием фитогемагглютинина и MLC-подобная реакция в мониторинге кризов отторжения

Подробные исследования в этом направлении выполнены Л.П.Алексеевым в 1971 - 1978 гг. (см. Л.П.Алексеев, 1978).

При динамическом регулярном обследовании пациентов было показано, что у больных, находящихся на стандартной иммуно-депрессивной терапии, интенсивность РБТ ниже, чем у здоровых индивидуумов. За 5 - 10 дней перед кризами отторжения и в период кризов происходила активация РБТ до уровня, характерного для здоровья индивидуумов.

Активация РБТ на фоне обычной иммунодепрессивной нагрузки служит сигналом к интенсификации иммунодепрессивной терапии, благодаря чему криз может быть купирован. Диагностическая ценность данного теста очень значительна - более чем в 80% случаев он совпадал или предшествовал клинически диагностируемым кризам отторжения.

Исследования, представляющие сейчас больше исторический интерес, выполненные с использованием морфологического метода учета РБТ, упомянуты здесь как свидетельство ранних работ в области иммунологического мониторинга.

Мониторинг специфической активности лимфоцитов реципиента по отношению к тканевым антигенам донора осуществляется с помощью другого клеточного теста - РБТ, стимулированной донорским антигенным материалом [Зарецкая Ю. М. и др., 1972; Алексеев Л. П., 1974].

Трудность использования этой чувствительной и специфической реакции в трансплантационной клинике состояла в двух моментах: во-первых, в отсутствии после пересадки донорского материала, индуцирующего РБТ; во-вторых, в длительности реакции, занимающей 6 - 7 дней, что снижало ее информативность.

Первая трудность была преодолена путем использования специально обработанных донорских спленоцитов, хранящихся в замороженном состоянии [Алексеев Л. П., 1974]. Сокращение времени реакции и повышение информативности теста было достигнуто на основе принципа вторичной MLC (см. 4.2.2).

В качестве отвечающих клеток Л. П. Алексеевым были использованы лимфоциты реципиента через 2 нед после пересадки и, следовательно, прошедшие in vivo примирование к антигенам донора.

Таблица 59

MLC-2-подобная реакция в иммунологическом мониторинге (адаптировано из Л. П. Алексеева, 1978)
Группа Характер стимулирующего антигена Число случаев MLO-активность (инкубация, ч)
72 144
До трансплантации   73 5,7±1,08 18,2±1,88
При стабильной функции трансплантата Донор 566 13,4±1,01 12,8±2,2
3-й партнер 410 5,9±0,84 17,3±18,1
При кризе отторжения Донор 269 55,4±4,45 34,7±3,20
3-й партнер 227 9,35±1,21 16,2±2,05

Используя в качестве донорского антигена специально приготовленные разрушенные спленоциты донора, Л. П. Алексеев (1974, 1978) показал, что в период криза отторжения активность MLC-2- подобной реакции возрастала в несколько раз по отношению к антигенам донора, в то время как против клеток 3-го партнера такого эффекта не наблюдалось. Эта активность оказалась специфичной: в период стабильной функции трансплантата она отсутствовала (табл. 59).

7.1.2. РБТ с использованием 14С-ацетата натрия как тест иммунологического мониторинга

Реакция бласттрансформации на ФГА, используемая нами как тест мониторинга в первые годы работы (6.3.2), отражала объективную закономерность - нарастание функциональной активности лимфоцитов перед кризами отторжения, однако имела определенные недостатки, связанные с запаздыванием получения информации. Как результат дальнейшего развития РБТ-теста для целей иммунологического мониторинга нами был апробирован метод с включением в трансформирующиеся культуры 14С-ацетата натрия вместо 3Н-тимидина, разработанный Ф. С. Барановой и JI. К. Поповой [Баранова Ф. С. и др., 1980] на основе описанного ими метода бласттрансформации на ФГА [Баранова Ф. С. и др., 1978]. Было показано, что включение 14С-ацетата натрия, измеренное после обработки клеточных культур 5% трихлорацетатом, значительно выше в ЛПК, стимулированных фитогемагглютинином, чем нестимулированных. Эти отличия зарегистрированы через 3 - 6 ч от начала стимуляции (индекс 2,0 ) и четко выявлялись через 16 - 24 ч. Результаты одного из экспериментов представлены на рис. 31; они подтверждены в нескольких независимых экспериментах.

Ингибиторы синтеза белка циклогексемид (в дозе 3,5 × 10-5 М) и эметин (в дозе 1 × 10-4 М) тормозили процесс включения 14С-ацетата в активированные и интактные клетки, причем торможение стимулированных клеток было более выраженным. Включение 14С-ацетата в клетки снижалось и в присутствии (в дозе 5 мг/мл) актомицина D, являющегося ингибитором синтеза RNA.

Рис. 31. Интенсивность включения 14С- ацетата в ЛПК. Фракция, осаждаемая 5% трихлорацетатом: 1 - при стимуляции ФГА; 2 - без ФГА. Каждая точка - среднее из пяти определений. Коэффициент вариации (/М)100 для каждой средней не более 5%
Рис. 31. Интенсивность включения 14С- ацетата в ЛПК. Фракция, осаждаемая 5% трихлорацетатом: 1 - при стимуляции ФГА; 2 - без ФГА. Каждая точка - среднее из пяти определений. Коэффициент вариации (σ/М)100 для каждой средней не более 5%

Обработка клеток митомицином С (в дозе 25 μr/мл), ингибитором синтеза DNA, не влияла на интенсивность включения 14С-ацетата в первые 24 ч культивирования. Обработка клеток 5% трихлоруксусной кислотой позволяла исключить из анализа вклад меченых низкомолекулярных продуктов внутриклеточного превращения ацетата и рассматривать отличия в интенсивности его включения в стимулированные и интактные клетки как следствие различной активности процессов синтеза белка, RNA и липидов [Pratt Н. et al., 1977]. Этот метод, позволяющий быстро учитывать функциональную активность мононуклеаров периферической крови, был оценен Ф. С. Барановой и Л. К. Поповой как тест иммунологического мониторинга на больных с трансплантатом аллогенной почки.

Рис. 32. Использование РБТ на ФГА (с включением 14С-ацетата) для целей иммунологического мониторинга кризов отторжения. Протокол мониторинга больного С. (по Ф. С. Барановой, Л. К. Поповой). Стрелками обозначены клинически диагностируемые кризы отторжения. Пояснение в тексте
Рис. 32. Использование РБТ на ФГА (с включением 14С-ацетата) для целей иммунологического мониторинга кризов отторжения. Протокол мониторинга больного С. (по Ф. С. Барановой, Л. К. Поповой). Стрелками обозначены клинически диагностируемые кризы отторжения. Пояснение в тексте

На обследовании находилось 25 больных. Особенности данного теста отражает протокол мониторинга больного С. (рис. 32). У больного в обследуемый период имели место 4 кризовых ситуации; за 5 - 2 сут до клинической манифестации криза отторжения у С. наблюдалось усиление включения 14С-ацетата натрия в культуры, стимулированные ФГА, при менее значительном повышении включения в нестимулированные культуры. Активация, как правило, предшествовала проявлению клинико-лабораторных признаков криза отторжения.

В дальнейшем был определен коэффициент корреляционного взаимоотношения между повышением включения 14С-ацетата Na в ФГА-стимулированные культуры, с одной стороны, и наступлением криза отторжения - с другой. При анализе 68 постановок РБТ на 16 больных коэффициент корреляции оказался равным 0,89 (табл. 60).

Таблица 60

Коэффициент корреляции между увеличением активности РБТ и манифестацией кризов отторжения
Повышение включения 14С R = 19 × 46 - 1 × 2 / (19 + 1) (19 + 2) (46 + 1) (46 + 2) = 0,89
    + -
Предкризовый период + 19 1
- 2 46

Полученные результаты позволяют сделать заключение о высокой информативности использованного метода в диагностике кризов отторжения и значительной его экспрессности, позволяющей регистрировать ответ лимфоцитов на ФГА через 24 ч от начала стимуляции.

предыдущая главасодержаниеследующая глава




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2013-2017
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://genetiku.ru/ "Genetiku.ru: Генетика"